脐带间充质干细胞的分离培养

wuxiao101325

组织块没怎么做过，消化法可以参考：http://www.stemcell8.cn/thread-18220-1-1.html

wuxiao101325

忘了你不能下载：
1 [3 ]* ~: K& k- p! P: ~脐带MSCs培养操作规程; L9 p& ?+ w& U1 i6 E# C5 _
1 无菌收集脐带，浸没于含1%双抗（青链霉素）的PBS中，玻璃容器密封送回实验室；
; Y4 z' K) k* i+ _; ?& i2 超净台上剪取合适长度脐带，用PBS洗净血污；' f5 ?0 D$ y7 o9 b1 o9 v' R
3 将脐带剪碎成肉糜状（2-3mm3），转移到100ml玻璃瓶中，每2cm脐带加入4ml的消化液（含0.25%胰酶，200~400U胶原酶Ⅱ/ml的PBS液），混匀，37℃摇床（150rpm）消化1小时；
1 b1 s  g8 w6 X9 [! r9 o& ~, {4 将含组织块的消化液，转移到25cm2细胞培养瓶中，加入DMEM/F12(Gibco,cat no 12400-024)培养基（含15%胎牛血清Gibco, Ref 10099-141），37℃、5%CO2孵箱培养；
1 h5 Z* s  v- N! Y5 约三天左右能在显微镜下观察到贴壁细胞，首次换液时间为接种后24-48H之间，半量换液后继续培养，三天后换液，细胞已经能稳定生长。每三天换液一次，至细胞80%融合（约10天左右），即可进行传代；2 {2 ?/ R; @) q0 k
6传代时去除培养基，用PBS洗涤贴壁细胞2次，加入1.5ml的消化液（含0.25%胰酶的PBS液），37℃条件下作用5-8min左右，加入等体积含血清的培养基中止消化，吸管轻吹贴壁细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液；将细胞悬液转移到15 ml离心管中，800rpm离心5min，弃上清，用适量DMEM/F12培养基重悬细胞，进行活细胞计数并计算细胞活率，以适中浓度1000—5000个/cm2浓度进行铺板，置于37℃、5%CO2孵箱中培养。# u$ X! ]% x/ d" [, K
7 细胞冻存时，按传代的操作步骤获得细胞沉淀，用冻存液（30%FBS＋5%二甲基亚砜+DMEM/F12培养基）重悬细胞，调整细胞浓度为5×106/ ml左右，将细胞悬液转移到冻存管中，1ml/管，用程控降温仪降温后转移到液氮中冻存。