请教：真核表达载体的构建

smiling

各位同仁：
" L" z# Z, U3 s9 [. q8 `我想请教真核细胞表达载体构建方面的知识。
# V& W% g: ~4 b7 n( q+ Y想在真核细胞中表达目的基因，但是目的基因DNA长12000bp，mRNA长3800bp，CDS长700bp。2 N4 N$ i/ p& o" g8 j" P. q
问题如下：只扩增目的基因的CDS或者ORF，然后连接到表达载体上，转染肌源干细胞表达。这样是否可行？, a7 Z) d. ]( `" z/ u( }
恳请诸位解惑！谢谢！

lixiaodong

多数都是这么做的。Splicing本身可能提高表达量，目前很多真核表达的载体的启动子后都接了个Intron，有助于提高表达。看你用什么启动子了。

smiling

回复 2# lixiaodong ! \3 v# a  Q% w$ s! E$ W7 ~( C

* A; _5 S* L% M9 H0 W打算用pIRES2-EGFP或者pEGFP-C1类似的。

hljzyydx

当然不可简单如此，首先你要确定你的载体上是否连有启动子，没有启动子你插入什么都没有意义了。其次你的载体或者DNA片段中有没有标志性的基因或者载体本身是否具有报告基因。也就是说你是否可以检测你的连接结果。

ziyunfei1982

直接提mRNA。逆转录扩增cDNA，选2个酶切位点，加入表达载体就可以了，

ziyunfei1982

真核表达载体就可以啊，pEGFP-C1就ok

smiling

回复 4# hljzyydx
% T4 e! r; D5 K. ?- p  Z1 i$ M, s$ h! F
连接结果好检测。就是转化DH5α，然后提取质粒，做酶切和PCR鉴定。谢谢！

smiling

回复 5# ziyunfei1982
* R! W; A) n1 K
  |) j! o! [2 A* P6 f4 b9 J
5 K* U. t$ y4 n; D7 ]! V    请问ziyunfei1982 ：
3 I6 r/ ~) a4 J: U你所指的加入酶切位点怎么理解？是加在引物上吗？

hljzyydx

回复 7# smiling 0 ]% v* ]; |9 _1 i7 T8 a+ F

" H% ~8 Q. C3 ~" ^3 m  @# [# [. l7 I' r1 Y
    按照你那么说的话不如直接测序呢，最简单，主要是以后他要用这个质粒的话，如果没有可行的检测方法没法知道目的基因的表达情况。。这才是最主要的！

ziyunfei1982

回复 8# smiling * T0 g4 `5 T, k. C7 i0 _( ]; `

% x& G/ ~" z+ K: }) f
8 S- W( H( r' B/ B7 @) D( ?    你的目的片段引物上加酶切位点，再加2-3个保护碱基，双酶切吧，