Cell子刊：诺奖团队揭开CRISPR基因编辑效率之谜

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Cell子刊：诺奖团队揭开CRISPR基因编辑效率之谜# k* C# E8 ]+ {* P8 Z0 m
来源：生物世界 2025-04-28 16:49
" q; j% V  ~- T! I% J' m6 B3 A这项研究颠覆了“PAM 越宽松越好”的传统认知，揭示特异性与效率的精准平衡才是关键。
: b+ E  V$ |  xCRISPR-Cas9 被誉为“基因魔剪”，但其编辑效率在不同场景下差异巨大。为何有些 Cas9 变体能高效编辑，而另一些却频频“失手”？! t# G" D6 U+ o1 U( h- u& F8 J9 K3 s
近日，Molecular Cell 期刊发表了最新研究揭示了背后的核心机，这项由诺奖得主 Jennifer Doudna 教授（博士后史弘略为论文第一作者）领衔的研究，究揭示了广泛 PAM 识别与基因组编辑效率之间的基本权衡，提出了高效的 RNA 引导的基因组编辑依赖于优化的两步靶标捕获过程，其中选择性但低亲和力的 PAM 结合优先于快速的 DNA 解旋。这不仅解开了 CRISPR-Cas9 基因编辑效率密码，还为设计更有效的 CRISPR-Cas 及相关 RNA 引导的基因组编辑器奠定了基础。
) s5 m6 a6 n, h! m! o3 Z这些发现也为长期以来关于 CRISPR-Cas9 基因编辑“是否要牺牲效率换取广谱性”的争议画上了句号。
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# ]% K. \( B) g1 hCas9 的“两步走”策略
5 h, A4 `( C! p- [) D+ o就像快递员通过邮编和门牌号精准投递，Cas9 通过两步精准定位 DNA 靶点：& t; h' i- L- _
1、PAM识别：Cas9 首先识别目标 DNA 上的 PAM 序列（例如 NGG），锁定目标区域；5 D: |& Y4 ^2 l( Q- B7 O7 [
2、DNA解旋：随后解开 DNA 双螺旋，让 gRNA 与靶序列配对，形成 R-loop 结构并切割 DNA 双链。3 b3 V( l& ]! F% X
关键发现：野生型 Cas9 与的 PAM 序列结合“快而松”——快速扫描大量非目标位点后迅速释放，一旦找到正确靶点则高效解旋。这种“点到即止”的策略，使其在复杂基因组中游刃有余。
6 A6 E6 i5 Z6 X宽松版 Cas9 的“效率陷阱”
. |5 c" i4 c2 u5 s8 N为扩大 Cas9 可靶向编辑的范围，科学家开发了 Cas9 变体——SpRY，这种宽松版 Cas9（PAM-relaxed Cas9）可识别几乎任何 PAM 序列，但这类工具却存在严重缺陷：
+ M; ^7 S- d. c) f陷入“温柔陷阱”：SpRY 与非目标 DNA 结合更紧密，在错误位点反复停留，犹如陷入泥潭；5 J( G; A# c4 `' O
解旋速度减慢：即使找到正确靶点，其解旋效率仅为野生型 Cas9 的1/3；
- v( |! f& T( O敌我不分：竞争实验显示，SpRY 在非目标 DNA 存在时效率暴跌 200 倍，而野生型几乎不受影响。
/ q: K) Q2 O) @! @( L& S: p研究团队通过单分子追踪技术（AuRBT）首次捕捉到动态过程：SpRY 在靶点处反复尝试解旋却频频失败，而野生型 Cas9 则“一气呵成”。这种“卡壳”现象源于其过强的初始结合力，导致能量屏障升高。
+ P- a6 B* J) l: O$ y设计新思路：平衡“搜索”与“剪切”8 O$ v0 @0 a/ q+ [2 V
研究提出基因编辑器优化法则：! u4 S5 {6 R% B* W4 L
1、弱化非特异性结合：避免工具酶被“无效位点”困住；2 u  s/ r% Z- e
2、加速靶点解旋：通过设计突变，降低 DNA 解旋能量壁垒；" }- Y! z/ J7 L: V, u! }/ Q
3、两步协同优化：在 PAM 识别与解旋速度间寻找最佳平衡点。, L% K; I# L( _% [" J/ v  R3 M
突破性验证：在靶点旁引入“DNA气泡”（削弱双螺旋稳定性），SpRY 效率瞬间恢复至野生型 Cas9 水平，印证了能量壁垒理论。* \* O! P! f/ X5 o
未来展望
3 w/ J1 v; E! u8 j  L这项研究颠覆了“PAM 越宽松越好”的传统认知，揭示特异性与效率的精准平衡才是关键。基于此，科学家可重新设计 Cas9 变体：4 p0 w% N" X1 L
开发“智能扫描”工具，在扩展靶点范围的同时保持高速搜索；2 h/ ?8 u( z$ k. n
优化古细菌来源的IscB/TnpB等新型编辑器，突破现有技术瓶颈；+ i2 S5 U% O. O1 b( r- P0 F1 G
助力遗传病治疗、作物改良等应用，让基因编辑更安全高效。4 G2 i. S+ S8 \; k1 C. v
研究团队表示，这项研究提示我们，不应该盲目追求去 PAM 化，未来基因编辑工具应构建一个多样化的“PAM工具箱”，为不同临床或科研需求选择合适的 Cas9 变体，而非妄图发出一个万能工具。
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