Cell子刊：诺奖团队揭开CRISPR基因编辑效率之谜

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Cell子刊：诺奖团队揭开CRISPR基因编辑效率之谜
, J% v/ ~" X3 K& l- I: [% _来源：生物世界 2025-04-28 16:49
8 u* Y- y1 d* o8 s* z5 Y这项研究颠覆了“PAM 越宽松越好”的传统认知，揭示特异性与效率的精准平衡才是关键。# J* L5 n( p9 l' h2 X5 U# a$ w% i
CRISPR-Cas9 被誉为“基因魔剪”，但其编辑效率在不同场景下差异巨大。为何有些 Cas9 变体能高效编辑，而另一些却频频“失手”？+ e3 W* `6 F  B3 }) b
近日，Molecular Cell 期刊发表了最新研究揭示了背后的核心机，这项由诺奖得主 Jennifer Doudna 教授（博士后史弘略为论文第一作者）领衔的研究，究揭示了广泛 PAM 识别与基因组编辑效率之间的基本权衡，提出了高效的 RNA 引导的基因组编辑依赖于优化的两步靶标捕获过程，其中选择性但低亲和力的 PAM 结合优先于快速的 DNA 解旋。这不仅解开了 CRISPR-Cas9 基因编辑效率密码，还为设计更有效的 CRISPR-Cas 及相关 RNA 引导的基因组编辑器奠定了基础。
* s. [4 o9 n2 Q3 {3 V这些发现也为长期以来关于 CRISPR-Cas9 基因编辑“是否要牺牲效率换取广谱性”的争议画上了句号。. J' a/ L, n. Z& m4 e# u

5 J# f/ G- B+ r4 c1 sCas9 的“两步走”策略, r& L/ o+ F, b" c7 y  e
就像快递员通过邮编和门牌号精准投递，Cas9 通过两步精准定位 DNA 靶点：7 |5 [+ h1 Q2 l- L3 k2 z
1、PAM识别：Cas9 首先识别目标 DNA 上的 PAM 序列（例如 NGG），锁定目标区域；
. G  r  x6 ^5 X2、DNA解旋：随后解开 DNA 双螺旋，让 gRNA 与靶序列配对，形成 R-loop 结构并切割 DNA 双链。, s( V. K# Z$ p4 B! ^
关键发现：野生型 Cas9 与的 PAM 序列结合“快而松”——快速扫描大量非目标位点后迅速释放，一旦找到正确靶点则高效解旋。这种“点到即止”的策略，使其在复杂基因组中游刃有余。
- v' ]+ j7 g3 I0 s& ~  ?宽松版 Cas9 的“效率陷阱”+ x. c# U+ {0 N- X: g' S- U0 y: T
为扩大 Cas9 可靶向编辑的范围，科学家开发了 Cas9 变体——SpRY，这种宽松版 Cas9（PAM-relaxed Cas9）可识别几乎任何 PAM 序列，但这类工具却存在严重缺陷：# k- P5 }/ _; ~5 q, Y+ t# _
陷入“温柔陷阱”：SpRY 与非目标 DNA 结合更紧密，在错误位点反复停留，犹如陷入泥潭；1 R' ]+ u8 b6 }5 R3 v  i1 W4 I
解旋速度减慢：即使找到正确靶点，其解旋效率仅为野生型 Cas9 的1/3；
- s; z$ u3 f6 ~: }$ U5 p敌我不分：竞争实验显示，SpRY 在非目标 DNA 存在时效率暴跌 200 倍，而野生型几乎不受影响。
, M; [( f# g: R  z7 h" ]9 w/ y$ l研究团队通过单分子追踪技术（AuRBT）首次捕捉到动态过程：SpRY 在靶点处反复尝试解旋却频频失败，而野生型 Cas9 则“一气呵成”。这种“卡壳”现象源于其过强的初始结合力，导致能量屏障升高。5 u) U2 ^& y- `7 c& [6 |0 ^7 K9 t
设计新思路：平衡“搜索”与“剪切”% x/ T7 ^& \! A% v( D
研究提出基因编辑器优化法则：
: j  Y+ n9 \9 W3 r' O$ M1、弱化非特异性结合：避免工具酶被“无效位点”困住；& ]/ Y/ v: k. I
2、加速靶点解旋：通过设计突变，降低 DNA 解旋能量壁垒；
& p2 p  ~) E, S8 K" Y6 l; M+ W3、两步协同优化：在 PAM 识别与解旋速度间寻找最佳平衡点。9 |! x/ D( A" S. o. X; O
突破性验证：在靶点旁引入“DNA气泡”（削弱双螺旋稳定性），SpRY 效率瞬间恢复至野生型 Cas9 水平，印证了能量壁垒理论。
0 {3 p6 Q8 }; b0 w! G5 _未来展望
( \7 D! p; M2 m  H; P这项研究颠覆了“PAM 越宽松越好”的传统认知，揭示特异性与效率的精准平衡才是关键。基于此，科学家可重新设计 Cas9 变体：/ Q9 W$ ^% [$ F! P5 z2 ]) ^3 p
开发“智能扫描”工具，在扩展靶点范围的同时保持高速搜索；
1 n2 _2 Z& K/ n6 Z) b优化古细菌来源的IscB/TnpB等新型编辑器，突破现有技术瓶颈；
' n2 }/ j" n' }1 f/ D" u- n助力遗传病治疗、作物改良等应用，让基因编辑更安全高效。  b. g( a1 t! T+ O( b
研究团队表示，这项研究提示我们，不应该盲目追求去 PAM 化，未来基因编辑工具应构建一个多样化的“PAM工具箱”，为不同临床或科研需求选择合适的 Cas9 变体，而非妄图发出一个万能工具。: \7 v# {" J0 a5 j* |* B3 h# }" m. P
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