Cell子刊：诺奖团队揭开CRISPR基因编辑效率之谜

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Cell子刊：诺奖团队揭开CRISPR基因编辑效率之谜! y# Y' k2 v+ J7 ~7 j
来源：生物世界 2025-04-28 16:491 t0 L. ]: M7 y5 \- D
这项研究颠覆了“PAM 越宽松越好”的传统认知，揭示特异性与效率的精准平衡才是关键。
0 L* f' @) f$ l0 nCRISPR-Cas9 被誉为“基因魔剪”，但其编辑效率在不同场景下差异巨大。为何有些 Cas9 变体能高效编辑，而另一些却频频“失手”？
6 r9 K  A1 X* \  ]! j0 \近日，Molecular Cell 期刊发表了最新研究揭示了背后的核心机，这项由诺奖得主 Jennifer Doudna 教授（博士后史弘略为论文第一作者）领衔的研究，究揭示了广泛 PAM 识别与基因组编辑效率之间的基本权衡，提出了高效的 RNA 引导的基因组编辑依赖于优化的两步靶标捕获过程，其中选择性但低亲和力的 PAM 结合优先于快速的 DNA 解旋。这不仅解开了 CRISPR-Cas9 基因编辑效率密码，还为设计更有效的 CRISPR-Cas 及相关 RNA 引导的基因组编辑器奠定了基础。
) {/ S+ E' Z9 d7 q+ _这些发现也为长期以来关于 CRISPR-Cas9 基因编辑“是否要牺牲效率换取广谱性”的争议画上了句号。- g2 Q' Y/ ]& |. t* _
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Cas9 的“两步走”策略" o& N1 u) m  ^0 g
就像快递员通过邮编和门牌号精准投递，Cas9 通过两步精准定位 DNA 靶点：+ E3 ^$ G, O" z1 o+ q, o1 A8 _
1、PAM识别：Cas9 首先识别目标 DNA 上的 PAM 序列（例如 NGG），锁定目标区域；9 I7 d4 i9 l: n$ X* M- n( }+ c/ I0 R
2、DNA解旋：随后解开 DNA 双螺旋，让 gRNA 与靶序列配对，形成 R-loop 结构并切割 DNA 双链。
0 W! K( w( ?% q5 i- c关键发现：野生型 Cas9 与的 PAM 序列结合“快而松”——快速扫描大量非目标位点后迅速释放，一旦找到正确靶点则高效解旋。这种“点到即止”的策略，使其在复杂基因组中游刃有余。
( W' @2 n0 l' A! R5 {; s) d宽松版 Cas9 的“效率陷阱”
) d" R2 e& X% Q1 q为扩大 Cas9 可靶向编辑的范围，科学家开发了 Cas9 变体——SpRY，这种宽松版 Cas9（PAM-relaxed Cas9）可识别几乎任何 PAM 序列，但这类工具却存在严重缺陷：
: `/ g* j; \  |9 y陷入“温柔陷阱”：SpRY 与非目标 DNA 结合更紧密，在错误位点反复停留，犹如陷入泥潭；
7 N! I/ }* z6 z  R" n& ]解旋速度减慢：即使找到正确靶点，其解旋效率仅为野生型 Cas9 的1/3；
: i5 ]3 @3 s' M* S. d6 w敌我不分：竞争实验显示，SpRY 在非目标 DNA 存在时效率暴跌 200 倍，而野生型几乎不受影响。
+ E! X$ R) E/ `4 u" ^# r$ `: u+ h研究团队通过单分子追踪技术（AuRBT）首次捕捉到动态过程：SpRY 在靶点处反复尝试解旋却频频失败，而野生型 Cas9 则“一气呵成”。这种“卡壳”现象源于其过强的初始结合力，导致能量屏障升高。0 @7 |5 W: }0 t4 ]8 D# V. C9 n
设计新思路：平衡“搜索”与“剪切”
8 S0 B1 G, ?- }1 I* Y& O/ f5 s+ w6 ]研究提出基因编辑器优化法则：
/ D0 M( I8 K; L7 F- t4 ~1、弱化非特异性结合：避免工具酶被“无效位点”困住；
; p& u9 n8 ?! s2、加速靶点解旋：通过设计突变，降低 DNA 解旋能量壁垒；
* ]: E9 U$ U7 E' X: n! _+ ]; }9 P3、两步协同优化：在 PAM 识别与解旋速度间寻找最佳平衡点。$ H+ k5 o2 g. _5 B
突破性验证：在靶点旁引入“DNA气泡”（削弱双螺旋稳定性），SpRY 效率瞬间恢复至野生型 Cas9 水平，印证了能量壁垒理论。/ @$ Z0 ]" V9 K6 n
未来展望! w7 G6 w; K$ m% [
这项研究颠覆了“PAM 越宽松越好”的传统认知，揭示特异性与效率的精准平衡才是关键。基于此，科学家可重新设计 Cas9 变体：
' P, O0 q! d1 u9 L' Z9 p开发“智能扫描”工具，在扩展靶点范围的同时保持高速搜索；
' O! ]1 S: v3 w7 B优化古细菌来源的IscB/TnpB等新型编辑器，突破现有技术瓶颈；; F9 O% h& E9 M' [2 J' p3 d. o) u3 ^
助力遗传病治疗、作物改良等应用，让基因编辑更安全高效。
. b( ~6 i; F' P6 G研究团队表示，这项研究提示我们，不应该盲目追求去 PAM 化，未来基因编辑工具应构建一个多样化的“PAM工具箱”，为不同临床或科研需求选择合适的 Cas9 变体，而非妄图发出一个万能工具。
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