关于用MEF做ES/iPS细胞鉴定的隐性对照问题。请看山中伸弥教授06年文章图片。

上海过客

最近再做 ｉＰＳ细胞的培养， 想鉴定一下 干性基因的表达情况。目的基因为 OCT 3/4,Sox2,Nanog,b-actin
/ S4 R  N9 s) Z. [+ Q* G0 W2 S0 |# {+ k, y1 F3 _0 w/ M2 E
OCT3/4 ,SOX2 是跨 内含子的 ，Nanog 是 没有内含子的基因序列 。
/ b1 }; r3 A) ]7 w. S
+ U- p  f3 ]4 e不管是 DNA酶处理或者是 不处理 RNA ，MEF都会 扩增出条带，。 但是条带很弱 。 这个问题 非常困扰我 。
  {, n, v. l$ P' c% B7 q$ g# u: g3 w* X7 T" j' Q0 r6 U
于是 经过  优化 ，把 PCR的循环次数从30改为25后 ，拍的照片MEF 就没有 三个干性基因的条带了。  _4 B6 @  K+ g5 C& Z
; r$ I# I6 ?5 t( I! O6 L
于是我翻出 yamnaka 06 年的那篇  Cell 对照了一下 。 这个 文献的这个照片 是不是 存在同样的问题？
* U- l. ]' c; F" {1 V8 C7 J" x/ @4 ?! _, u/ }2 I

8 ^) I4 ?6 m. ^, j+ aSOX2，OCT3/4,NANOG 的三个基因在 iPS中的 表达条带都很低，ES很高，MEF 根本就没有条带 。既然 iPS和 ES 的干性差不多，那么条带也差不多 亮 。   
& ~1 x: K" q: \( |
. L1 _/ g* E( z7 p5 H6 N4 H. P我想 这篇文章里的 PCR 循环次数如果 加到很高 ，iPS 的 SOX2,OCT，NANOG  的条带会很亮，同时MEF可能 会 扩增出条带 。   
4 Q7 \& g0 G2 t. b. o1 R1 r- D/ |" `6 z# S; l
9 r- n2 f  h, V- Q+ |
这个就是我的问题 ，MEF中 本来就有细胞表达这些干性基因。   06年的文献 故意避开了这个问题 。  
+ _- g. G. J0 |# i$ L, Y* u
8 _8 f# T' v3 H$ }
6 k+ w! A- U6 J) ?+ N. r请大家讨论 一下 ，有说的不明白的地方请指出 。 我 会 补充

栀子花开

MEF 的Nanog是可以隐约看出条带的，不知道原文中说没说PCR的循环次数

have-a-rest

PCR结果就是这么不可信！

刘实

引了你的文并发了评， 见http://blog.sina.com.cn/s/blog_502041670100jec6.html

上海过客

MEF 的Nanog是可以隐约看出条带的，不知道原文中说没说PCR的循环次数
( Y2 H, ]  F  k$ i栀子花开 发表于 2010-6-29 13:52

$ w+ D' y7 H1 Q+ e; N7 L

4 l- b  E, d1 pNANOG  这个基因 比较 特殊 没有内含子 ，所以如果有基因组污染的话 ，可以扩增出来。   
" B3 U: g. |1 b  m0 x" J6 @$ l& I! I; p0 _
! w. U, R2 }" ?3 B% H) ^
也不知道怎么下这个结论。 请大家 多讨论。

marrowstem

Very good question.
* h" S+ c6 f8 f3 n建议深挖，说不定挖出一个“大宝藏”。- t/ u. O  ]/ t
有时不妨相信一次自己的直觉判断，然后设法求证。

上海过客

Very good question.
& b0 s! \- ~$ Q* T9 |9 a, `建议深挖，说不定挖出一个“大宝藏”。
3 C1 x! Z3 B! e9 n  s. q+ c有时不妨相信一次自己的直觉判断，然后设法求 .../ C' Q; d3 ]& n, l( O3 H9 T
marrowstem 发表于 2010-6-30 22:28

5 q9 j) C9 U8 G9 E! W1 T" o
6 A0 e4 P" k) r6 |3 ^, G! {8 \为 了 做判断 。我已经决定 用 提的 总 RNA  来 直接做PCR ，如果 PCR 有条带，说明 有 基因组的污染。
, t! @/ M" Z& v: }# X' e( w9 y" ^  C! a( W; R' Q1 o
DNA酶的处理和 RNA的提取方法 还需要改进。

上海过客

NANOG  这个基因 比较 特殊 没有内含子 ，所以如果有基因组污染的话 ，可以扩增出来。   
- `, |" y" M9 J
' ~) ~$ @" o( P4 `$ L& _4 A) G9 A5 s" G  H- ~& A
也不知道 ...
/ s9 e) o4 D4 n上海过客 发表于 2010-6-30 17:55

8 `6 k; b! B' a/ o. N9 F- t- u
搞错了 SOX2 没有内含子 。 不好意思 。

上海过客

为 了 做判断 。我已经决定 用 提的 总 RNA  来 直接做PCR ，如果 PCR 有条带，说明 有 基因组的污染。 ...
* r; D) J  j* d8 G( v' y上海过客 发表于 2010-6-30 23:20

3 y3 ^4 p$ W: C. G  i3 `: P6 O
2 S! i  t  _8 U& M" X3 ]& Q$ r这个 也不是太懂，今天才搞懂 ，  山中文章图片里最后一栏 的 RT-MInus  就是 直接用RNA样品来做 PCR 以检测 RNA 样品里是不是有 DNA模板的污染 。: v8 S( k1 W( A
9 h3 \, z$ O4 r3 @  f5 `7 L
我看了一下大概 RT-MInus   就是这个意思 ，不知道 理解的对不对？

上海过客

这篇文献的  WESTERN 的 结果。 可以对照 RT-PCR 的 结果 。  OCT3/4,Sox2,基因 RT结果 iPS 与ES 基因差别较大 ，蛋白印迹 确实差不多的 强度 ？什么原因？
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( H* K  \9 L! k7 O: r: E 蛋白印迹内标换为  β-actin .  RT-PCR  为什么要用 Nat1 来做内标 ？  搞不太懂 。