关于用MEF做ES/iPS细胞鉴定的隐性对照问题。请看山中伸弥教授06年文章图片。

上海过客

最近再做 ｉＰＳ细胞的培养， 想鉴定一下 干性基因的表达情况。目的基因为 OCT 3/4,Sox2,Nanog,b-actin
7 e6 r9 q( o6 v+ Y+ Z. a& c! _( V
7 G: S% j4 U2 D9 eOCT3/4 ,SOX2 是跨 内含子的 ，Nanog 是 没有内含子的基因序列 。
  X( {  |+ Z4 U7 l: Z6 z, V2 x  ?& |+ K$ S' d5 P# p. ]
不管是 DNA酶处理或者是 不处理 RNA ，MEF都会 扩增出条带，。 但是条带很弱 。 这个问题 非常困扰我 。1 E6 X. n1 @* T+ B. y( K

8 M: v8 G# ~/ ?$ m8 o2 h于是 经过  优化 ，把 PCR的循环次数从30改为25后 ，拍的照片MEF 就没有 三个干性基因的条带了。. s% ^) w9 X9 h# f3 [6 M
4 O; e  q% r; |  A8 i* I
于是我翻出 yamnaka 06 年的那篇  Cell 对照了一下 。 这个 文献的这个照片 是不是 存在同样的问题？
) {5 h; l1 ?7 r& N. Z$ P) F3 f5 @
0 t6 M* H6 o# m) M' F) W! o! a
) [. r) P2 @) _0 f' T! MSOX2，OCT3/4,NANOG 的三个基因在 iPS中的 表达条带都很低，ES很高，MEF 根本就没有条带 。既然 iPS和 ES 的干性差不多，那么条带也差不多 亮 。   
# W& s  g1 e5 ?2 {$ t
6 A* [2 J. a. M- D6 G+ R& q  M  u我想 这篇文章里的 PCR 循环次数如果 加到很高 ，iPS 的 SOX2,OCT，NANOG  的条带会很亮，同时MEF可能 会 扩增出条带 。    4 A$ Y2 Z1 F; k$ u

! O1 g- ^. U, N' e; N! A8 H( \1 T# N3 u9 y3 M/ o, [' p- J5 y
这个就是我的问题 ，MEF中 本来就有细胞表达这些干性基因。   06年的文献 故意避开了这个问题 。  
1 m  ^4 J. x2 q$ |3 D- M
7 @- ~6 Q/ G: g
2 r. `  q  W$ h# B0 e: Y请大家讨论 一下 ，有说的不明白的地方请指出 。 我 会 补充

栀子花开

MEF 的Nanog是可以隐约看出条带的，不知道原文中说没说PCR的循环次数

have-a-rest

PCR结果就是这么不可信！

刘实

引了你的文并发了评， 见http://blog.sina.com.cn/s/blog_502041670100jec6.html

上海过客

MEF 的Nanog是可以隐约看出条带的，不知道原文中说没说PCR的循环次数
' G3 r# T5 I; e5 |栀子花开 发表于 2010-6-29 13:52

2 A' V9 Y5 C4 p* l' Y
' b! z/ I& s( h$ X
NANOG  这个基因 比较 特殊 没有内含子 ，所以如果有基因组污染的话 ，可以扩增出来。   
( u* P5 r) H' k+ [7 T7 L0 U; ?
0 A4 t, g+ x' l8 T' N5 u: X$ @& {! [! i- \
也不知道怎么下这个结论。 请大家 多讨论。

marrowstem

Very good question.( O7 W# X, y) K+ ^
建议深挖，说不定挖出一个“大宝藏”。
6 h  B+ U: U- Q$ r有时不妨相信一次自己的直觉判断，然后设法求证。

上海过客

Very good question.
* Y# Z- i, x# o) f5 i建议深挖，说不定挖出一个“大宝藏”。
" C- u; [0 F1 v& u* O$ H有时不妨相信一次自己的直觉判断，然后设法求 ...; [  u2 v6 t9 K$ E% G  Y
marrowstem 发表于 2010-6-30 22:28

) \3 l$ I! s5 c7 F9 b! B; d; p' u0 g( R+ K
为 了 做判断 。我已经决定 用 提的 总 RNA  来 直接做PCR ，如果 PCR 有条带，说明 有 基因组的污染。
/ k! w8 M; C1 [/ N/ `6 B! V- i6 H& j8 V2 y
DNA酶的处理和 RNA的提取方法 还需要改进。

上海过客

NANOG  这个基因 比较 特殊 没有内含子 ，所以如果有基因组污染的话 ，可以扩增出来。   
. Z' v  c7 D# C# e! l
2 d* D+ d( M) ]; {  Z& c4 Q( V# q- H8 t; P$ @1 ~
也不知道 ...
+ f6 U3 m% c! f0 y上海过客 发表于 2010-6-30 17:55

* g. g  f% W4 s$ }+ k( z
搞错了 SOX2 没有内含子 。 不好意思 。

上海过客

为 了 做判断 。我已经决定 用 提的 总 RNA  来 直接做PCR ，如果 PCR 有条带，说明 有 基因组的污染。 ...
- `0 s6 S' {+ A- w上海过客 发表于 2010-6-30 23:20

& z: v( o- u: a" [% F# @4 d
7 p. V% O) u3 Q- L$ d
这个 也不是太懂，今天才搞懂 ，  山中文章图片里最后一栏 的 RT-MInus  就是 直接用RNA样品来做 PCR 以检测 RNA 样品里是不是有 DNA模板的污染 。
% q1 p( [/ E4 L, c: T1 m& b- ^% M7 l6 n6 Z
我看了一下大概 RT-MInus   就是这个意思 ，不知道 理解的对不对？

上海过客

这篇文献的  WESTERN 的 结果。 可以对照 RT-PCR 的 结果 。  OCT3/4,Sox2,基因 RT结果 iPS 与ES 基因差别较大 ，蛋白印迹 确实差不多的 强度 ？什么原因？
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蛋白印迹内标换为  β-actin .  RT-PCR  为什么要用 Nat1 来做内标 ？  搞不太懂 。