关于用MEF做ES/iPS细胞鉴定的隐性对照问题。请看山中伸弥教授06年文章图片。

上海过客

最近再做 ｉＰＳ细胞的培养， 想鉴定一下 干性基因的表达情况。目的基因为 OCT 3/4,Sox2,Nanog,b-actin
: R2 G5 r2 H1 _( O! F2 t# w
9 L% l' M5 L3 r( A) J3 \% Y- `& s* UOCT3/4 ,SOX2 是跨 内含子的 ，Nanog 是 没有内含子的基因序列 。
  J  }$ v+ P7 J7 `& I6 F2 A6 v0 Y( J3 u6 u2 M. a% q9 J7 |
不管是 DNA酶处理或者是 不处理 RNA ，MEF都会 扩增出条带，。 但是条带很弱 。 这个问题 非常困扰我 。3 H8 F, Q0 L4 f# g6 V

- z0 v. B# c' |# V; O6 s; I于是 经过  优化 ，把 PCR的循环次数从30改为25后 ，拍的照片MEF 就没有 三个干性基因的条带了。% Q2 q3 E  D  o

. {% Q, ?( ~1 I+ y( m$ M$ z$ n于是我翻出 yamnaka 06 年的那篇  Cell 对照了一下 。 这个 文献的这个照片 是不是 存在同样的问题？
* C7 V' d% E' a
: W, t9 U2 s. e% Z7 |7 B. Q! N- A! n# c1 R( _
SOX2，OCT3/4,NANOG 的三个基因在 iPS中的 表达条带都很低，ES很高，MEF 根本就没有条带 。既然 iPS和 ES 的干性差不多，那么条带也差不多 亮 。   " S% g2 v. z$ H. U8 l
  X9 N# m" x: h7 f/ [
我想 这篇文章里的 PCR 循环次数如果 加到很高 ，iPS 的 SOX2,OCT，NANOG  的条带会很亮，同时MEF可能 会 扩增出条带 。    % |$ H. c) M  C1 }9 b
0 x; T; s% U+ }6 I

9 `, l$ o. q, T- h这个就是我的问题 ，MEF中 本来就有细胞表达这些干性基因。   06年的文献 故意避开了这个问题 。  $ ^- e  e4 Q7 V; L0 r3 @) T

) _+ z7 D1 g/ v7 m/ y
( ~) x+ P# \8 D% v6 ^; z6 o请大家讨论 一下 ，有说的不明白的地方请指出 。 我 会 补充

栀子花开

MEF 的Nanog是可以隐约看出条带的，不知道原文中说没说PCR的循环次数

have-a-rest

PCR结果就是这么不可信！

刘实

引了你的文并发了评， 见http://blog.sina.com.cn/s/blog_502041670100jec6.html

上海过客

MEF 的Nanog是可以隐约看出条带的，不知道原文中说没说PCR的循环次数1 r/ Q7 w+ X. i: u0 A
栀子花开 发表于 2010-6-29 13:52

5 W5 M' ?* k7 t
  q1 x1 P& {+ X- x& Y+ [
NANOG  这个基因 比较 特殊 没有内含子 ，所以如果有基因组污染的话 ，可以扩增出来。   
" c0 J1 Q$ \6 r5 c/ t& T+ b
4 L' x6 M( [' K; R0 z  Z- w2 u" o; X2 {% b8 Z
也不知道怎么下这个结论。 请大家 多讨论。

marrowstem

Very good question.
9 o! v  Z3 l" J; {" p3 p+ s建议深挖，说不定挖出一个“大宝藏”。
2 E7 P: Z) t/ j, n  T* J# y) X: M有时不妨相信一次自己的直觉判断，然后设法求证。

上海过客

Very good question.
' b$ ^& v* i( r$ R$ `建议深挖，说不定挖出一个“大宝藏”。/ r1 K7 l" F; W  T8 D# `  e* J* F* S- r
有时不妨相信一次自己的直觉判断，然后设法求 ...- w6 q$ I9 W& a# P: `5 ?2 Y1 c
marrowstem 发表于 2010-6-30 22:28

$ H6 X8 }6 Y9 T& f* X( d
; H7 e, q- @2 L
为 了 做判断 。我已经决定 用 提的 总 RNA  来 直接做PCR ，如果 PCR 有条带，说明 有 基因组的污染。
+ u/ _. e1 q3 @# E3 b( R- ?! [
% b) i& a$ F" t; L9 G DNA酶的处理和 RNA的提取方法 还需要改进。

上海过客

NANOG  这个基因 比较 特殊 没有内含子 ，所以如果有基因组污染的话 ，可以扩增出来。   7 D7 M3 N+ y! Q: O

* ?+ g; {: X: f, n* l7 c
) g4 x* I7 V% C- y$ G  t% Z也不知道 ...6 `- U: j& N  @0 R& r4 Q7 q# [
上海过客 发表于 2010-6-30 17:55

3 T0 _6 Z. @6 X4 r
搞错了 SOX2 没有内含子 。 不好意思 。

上海过客

为 了 做判断 。我已经决定 用 提的 总 RNA  来 直接做PCR ，如果 PCR 有条带，说明 有 基因组的污染。 ...
$ d' D. s& Q: T: u上海过客 发表于 2010-6-30 23:20

' E( b4 y: J: w- D$ s0 k) g
+ k5 v% S0 P8 |- p
这个 也不是太懂，今天才搞懂 ，  山中文章图片里最后一栏 的 RT-MInus  就是 直接用RNA样品来做 PCR 以检测 RNA 样品里是不是有 DNA模板的污染 。
3 r/ i0 ^) y6 {' q2 I# r4 e- S
' ^- D, O2 ]* D. H8 D我看了一下大概 RT-MInus   就是这个意思 ，不知道 理解的对不对？

上海过客

这篇文献的  WESTERN 的 结果。 可以对照 RT-PCR 的 结果 。  OCT3/4,Sox2,基因 RT结果 iPS 与ES 基因差别较大 ，蛋白印迹 确实差不多的 强度 ？什么原因？
% P: x  C& V6 ~; k" [3 U* f; j# Q% H: r4 \0 f. I

' W- i: b8 C: C: H( u! w- n! A7 V8 u7 ]5 F: `# M6 o' b
蛋白印迹内标换为  β-actin .  RT-PCR  为什么要用 Nat1 来做内标 ？  搞不太懂 。