关于用MEF做ES/iPS细胞鉴定的隐性对照问题。请看山中伸弥教授06年文章图片。

上海过客

最近再做 ｉＰＳ细胞的培养， 想鉴定一下 干性基因的表达情况。目的基因为 OCT 3/4,Sox2,Nanog,b-actin9 r4 c, n# ?% O# e7 q

' y2 {2 ~. V' c3 i/ a& NOCT3/4 ,SOX2 是跨 内含子的 ，Nanog 是 没有内含子的基因序列 。
/ _0 p& T+ O6 X8 N. \1 Q7 [0 W1 E& L% h2 v" v- \
不管是 DNA酶处理或者是 不处理 RNA ，MEF都会 扩增出条带，。 但是条带很弱 。 这个问题 非常困扰我 。
4 Y3 k1 t! K# D. d
8 [/ }+ l, d1 I7 F. w# e于是 经过  优化 ，把 PCR的循环次数从30改为25后 ，拍的照片MEF 就没有 三个干性基因的条带了。3 B. Z  j7 `7 r; j

: v' q! L4 h) h$ ]$ ^. [* ]; ]于是我翻出 yamnaka 06 年的那篇  Cell 对照了一下 。 这个 文献的这个照片 是不是 存在同样的问题？" Z6 H4 H+ O8 A  ?; h1 |
* x) F4 ]4 M* G3 Y9 q2 ?# W3 f2 r, d
- W, t+ R6 M$ M5 E! }1 A
SOX2，OCT3/4,NANOG 的三个基因在 iPS中的 表达条带都很低，ES很高，MEF 根本就没有条带 。既然 iPS和 ES 的干性差不多，那么条带也差不多 亮 。   2 V  q( ~6 x% v9 h1 j6 N

# S0 a" u0 F: U. g* \我想 这篇文章里的 PCR 循环次数如果 加到很高 ，iPS 的 SOX2,OCT，NANOG  的条带会很亮，同时MEF可能 会 扩增出条带 。   
& T5 g  f8 L2 T  D+ y) x( g7 q8 d$ U8 D& l9 y

1 F- W' v0 H& {这个就是我的问题 ，MEF中 本来就有细胞表达这些干性基因。   06年的文献 故意避开了这个问题 。  
9 I5 O( i, X6 X8 c, a; H6 g) |& m% ?3 H+ }

. F) N( x3 I% O5 _) _) r请大家讨论 一下 ，有说的不明白的地方请指出 。 我 会 补充

上海过客

MEF 的Nanog是可以隐约看出条带的，不知道原文中说没说PCR的循环次数  w/ s0 B) B9 e6 v3 U7 I3 b
栀子花开 发表于 2010-6-29 13:52

0 F2 {7 H6 H. f5 G+ _5 e: I0 G" T: l: e7 B) k3 N/ H
NANOG  这个基因 比较 特殊 没有内含子 ，所以如果有基因组污染的话 ，可以扩增出来。   
/ b8 r& `9 _0 Y0 J( ~+ B4 W( p0 u+ B# H) @- m: V& T
, e' q  b2 E% a* e
也不知道怎么下这个结论。 请大家 多讨论。

上海过客

Very good question.2 @* C+ M  D8 P. G* W3 \
建议深挖，说不定挖出一个“大宝藏”。
& w; w: N* |" [, I  q7 w: H/ A有时不妨相信一次自己的直觉判断，然后设法求 ...7 S) i' K4 n9 ~5 H. ]$ h$ z& H1 Z; t
marrowstem 发表于 2010-6-30 22:28

0 ]8 q( {' h# P

3 ?% D# x: P" n3 \  c, K1 @为 了 做判断 。我已经决定 用 提的 总 RNA  来 直接做PCR ，如果 PCR 有条带，说明 有 基因组的污染。
8 d7 L  @3 O+ {
. r: _, i/ W6 h DNA酶的处理和 RNA的提取方法 还需要改进。

上海过客

NANOG  这个基因 比较 特殊 没有内含子 ，所以如果有基因组污染的话 ，可以扩增出来。   5 G* k4 l8 |4 a9 q; v0 h

* K& v0 p# }+ L7 r/ \" q" B1 Z$ t$ Q7 J5 T* t; p2 S
也不知道 ...* }- `: U, ^( M
上海过客 发表于 2010-6-30 17:55

; a; \8 \/ ?' D1 [搞错了 SOX2 没有内含子 。 不好意思 。

上海过客

为 了 做判断 。我已经决定 用 提的 总 RNA  来 直接做PCR ，如果 PCR 有条带，说明 有 基因组的污染。 ...( e4 z) G) O+ ?3 `
上海过客 发表于 2010-6-30 23:20

2 H0 x5 x- k; T% b3 F
, m# H% [+ Y- |- f
这个 也不是太懂，今天才搞懂 ，  山中文章图片里最后一栏 的 RT-MInus  就是 直接用RNA样品来做 PCR 以检测 RNA 样品里是不是有 DNA模板的污染 。0 h2 }6 P' J. [- i0 h
6 q1 a9 u6 q& ^2 T1 O
我看了一下大概 RT-MInus   就是这个意思 ，不知道 理解的对不对？

上海过客

这篇文献的  WESTERN 的 结果。 可以对照 RT-PCR 的 结果 。  OCT3/4,Sox2,基因 RT结果 iPS 与ES 基因差别较大 ，蛋白印迹 确实差不多的 强度 ？什么原因？
: ^/ Q2 Q$ p! F: d: O
' e8 S4 ]3 Q. X% U2 _# R
4 D0 U# P7 u3 y" m
0 M, p8 s  Y+ p9 q 蛋白印迹内标换为  β-actin .  RT-PCR  为什么要用 Nat1 来做内标 ？  搞不太懂 。

上海过客

回复  上海过客 / r$ t/ o4 Y' U: a
beta-actin mRNA丰度太高，可能不适于作半定量RT-PCR，作Western则易于检测（但有文章说G ...$ L& E+ s* x2 D; K; F: M
lixiaodong 发表于 2010-7-3 14:03

" T3 P7 B5 G* n: C# Y. q

% K; n# b9 w3 M+ I* ]+ w( b3 Z% x现在的实验还都是做群体的 细胞  效应，单分子水平很难 做 。  单个细胞表达 GFP 可能在  群体里 也体现不出来 。  我并没有 否定 他的论文，只是 感觉到的确是有些问题解释的不太清楚 。   
; _# X: R6 T/ p- c1 E; T: D9 ~" X8 l/ @. M$ I# M/ E
    PNAS 上现在 有一篇文献 说明 在 成纤维细胞中提纯了 多能干细胞 。如果是这类细胞  被重编程呢 ？      
7 y/ G+ T0 u, \* R5 S
( J4 H2 b. @9 [% a    关于内标的问题 ，我也仔细看过 了 文献 ，β-actin ，GAPDH， 16SRNA 都可以做 内参 ，但是 怎么选 ？ β-actin  虽然在普通细胞中 不变，但是 干细胞中，尤其分化过程中变化很大，做过的同学 知道 。GAPDH 是糖代谢的 基因， 胚胎干细胞和普通细胞的代谢途径 不同 ，这个 大家 知道吧 ？  尤其是小鼠的 ES细胞的 代谢 途径，去年有最新的文献 。  但是选NAT1 是什么道理 ？   . y& L$ Z' Y& E( B0 e+ O) e
3 B; v: E  J. Y
      PCR 本来就是来做 鉴定的 ，如果有 假阳性。对于这么一个 突破性的进展论文，有些牵强 。  real-time PCR  为什么没有做呢？   曲线 就很容易 看到区别了吧 。              那 他不做 ，有机会，我来做real-time  PCR  吧  。

上海过客

yamanaka第一篇文章中的iPS有很多是重编程不完全的，直到用Nanog-GFP(2007 Nature)作为reporter后，所得到的 ..., ^( }. C& \- ]' w5 A
cicadacjk 发表于 2010-7-3 14:27

# U2 d3 |* r) p

' ]! z% g, g3 i% m谢谢 你的回答 ，你的回答 引导我更深入的 学习这篇文章。  ; `; ?' H+ a4 R0 E: d4 \. `% f
# \( q5 e* g7 r! e8 o
这篇文章 ，我看了 至少有5遍了，注满了注释，但是可能还是没有看懂 。如果你有时间的话 ，请详细再解读一下这篇文章 。
+ h& Y( Q0 F0 o4 T7 e
. J; E7 {: U7 \: v: f          谢谢

上海过客

可能有许多地方 考虑的不周到 ，希望大家不要见笑。:handshake