胃癌BGC823肿瘤细胞系SP表型初步分析 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 11:51 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：耿莉作者单位：山东大学齐鲁医院病理科，济南 250012
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      【摘要】  目的  观察人胃癌BGC823肿瘤细胞系中是否含有SP细胞及SP细胞的形态特点，并验证该表型细胞与干细胞标志物(ABCG2)的关系。方法  取贴壁生长的BGC823细胞，经Hoechst33342染色，于荧光显微镜下观察细胞染色情况，并观察拒染或浅染的SP细胞的形态特点，计算其百分比；之后对细胞爬片进行Hoechst33342染色和ABCG2的免疫荧光染色，于荧光显微镜下观察Hoechst33342染色强度和ABCG2的表达情况。结果  荧光显微镜下可见BGC823细胞系中存在SP细胞，且该类细胞体积较小，约占细胞总数的1.8%；免疫荧光染色可见爬片细胞中ABCG2 细胞即为SP表型细胞。结论  人胃癌BGC823细胞系中存有SP细胞，且该表型细胞表达干细胞标志物ABCG2。 ) J5 M" p( n  j, w: s
      【关键词】胃肿瘤肿瘤干细胞侧群细胞


GENG Li1，　REN Ning2， DONG Wei3，　YANG Yi4，　LI Jinsong1
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（1. Department of Pathology, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China;# z( t" U7 G  U4 m0 ?/ E
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2. Department of Pathology, Jinan First People′s Hospital, Jinan 250011, China;

3. Department of Pathology, Weifang Traditional Chinese Medicine Hospital, Weifang 261041, Shandong, China;

4. Department of Pathology, Yankuang Group Hospital, Zoucheng 273500, Shandong, China）
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To explore side population (sp) phenotypes in the gastric cancer cell line BGC823 and to observe the morph of SP cells and the relationship between SP phenotype and stem cell marker ABCG2. MethodsAdherent BGC823 cells cultured in culture flasks were determined by fluorescence microscopy after being stained with Hoechst33342, and the percentage ofSP cells was determined. The adherent cells were mounted on a cover slip and stained with Hoechst 33342, and subsequently stained with mouse antihuman antibody and fluoresence antibody labeled by FITC. The staining of Hoechst33342 and expression of ABCG2 were determined by fluorescence microscopy. ResultsA SP phenotype was found in the BGC823 cell line, and it was small and occupied about 1.8% of all tumor cells, and SP cells could express the ABCG2 phenotype. ConclusionSP cells exist in the gastric cancer cell line BGC823 and can express the stem cell marker ABCG2.& u5 y5 F  @8 m1 S/ H
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Key words:Gastric neoplasm； Tumor stem cell； Side population cells1996年Goodell等［1］1797首次用Hoechst33342染色于骨髓细胞中发现了一群染色很浅的细胞，称为侧群（side population，SP）细胞，其比例不到0.1%，体积较小，表达干细胞标志物（Sca1  Lin-/low）。之后也有研究证明SP细胞具有类似于干细胞的自我更新和多向分化潜能，在一定程度上可以代表干细胞。利用SP细胞外排荧光染料的特性，再结合流式细胞仪就可以将这其分离出来。最近，已有越来越多的研究者将SP细胞分离法用于对干细胞的分离分析中。胃癌是我国的高发恶性肿瘤之一，而目前国内外对胃癌干细胞的研究尚处于探索阶段。本研究旨在确定人胃癌BGC823肿瘤细胞株中是否存在SP细胞，并观察SP细胞的形态特点及其与干细胞标志物 (ATPbinding cassette superfamily G member 2 ，ABCG2)的关系，为进一步分离和研究胃癌干细胞提供线索和基础。

1材料与方法9 `0 {7 ~+ u5 F+ u0 [6 [: b

1.1材料人胃癌细胞株BGC823（凯基生物），RPMI1640培养基（Gibco），标准胎牛血清（天津血液病研究所），胰蛋白酶（Amresco），Hoechst33342（Sigma），鼠抗人ABCG2抗体（R＆D System），FITC标记荧光二抗、3%H2O2、血清封闭液（中杉金桥公司）。) E0 r5 e' y& T% D0 D8 d' d7 A
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1.2仪器CO2恒温细胞培养箱及恒温水浴箱（Heraeus），倒置显微镜(Olympus)，超净工作台(Air Tech)，超速离心机(Sigma)，荧光倒置显微镜(Leica)。

1.3细胞培养人胃癌BGC823细胞株用含有10%胎牛血清、青霉素100?U/mL、链霉素100?μg/mL的1640培养基，于37?℃、5% CO2恒温培养箱中培养，根据细胞生长的速度及培养基的颜色更换培养基，一般为2?d 1次。用0.25%的胰蛋白酶消化传代，实验时用对数生长期的细胞。

1.4荧光显微镜观察Hoechst 33342染色取对数生长期的BGC823细胞，弃去旧培养液，加入含有2鸖的1640培养液2?mL，再加入Hoechst33342至终浓度为5?μg/mL，37?℃避光孵育90?min。PBS冲洗2次，加入含2鸖的1640培养液1?mL，于倒置荧光显微镜下观察，SP细胞应为拒染或浅染的细胞。观察SP细胞的形态特点，并随机取5100视野，分别计数100个细胞，计算SP细胞所占比例。
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1.5免疫荧光检测细胞表面抗原ABCG2的表达按细胞传代的步骤将细胞冲洗、消化、吹打成细胞悬液，将细胞悬液滴加至六孔培养板中的盖玻片上，每孔轻轻补加培养液，放入培养箱中过夜。吸去孔中' a) P, c/ s- p; a. |( h
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2结果

2.1Hoechst 33342染色结果在紫外光激发下，于荧光显微镜下可见BGC823细胞株中大部分细胞胞核被Hoechst 33342染色呈现蓝色荧光，少部分细胞胞核蓝光较弱，在明视场下可见这些细胞的轮廓（图1）。这类细胞体积较小，即为SP细胞。计数BGC823细胞系中SP细胞约占细胞总数的1.8%。

荧光显微镜下观察Hoechst33342浅染的BGC823细胞（200）

2.2免疫荧光染色结果荧光显微镜下观察可见ABCG2表达阳性者，显示胞膜的绿色荧光，同一视野下用紫外激发光就可以发现，ABCG2 细胞即为Hoechst33342拒染或浅染的细胞，且细胞体积较小，即为SP细胞（图2）。图2荧光显微镜观察BGC823细胞中ABCG2 细胞（200）/ N( \; I3 L6 V) E2 K/ {$ n

　　3讨论
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自1996年Goodell等［1］1806首次于骨髓细胞中发现具有干细胞特性的SP细胞后，研究者又从许多重要的其他组织器官中发现了SP细胞的存在，如骨骼肌、乳腺、肝、脑、肾等，证明SP细胞群比例从0.05%～3.6%不等，其表达干细胞标志物却不表达分化成熟的细胞表型，并具有干细胞特性，如参与了相应组织的更新与再生、器官系统的自我重建以及成体干细胞的多器官可塑性等［2］。这些研究都证明，SP细胞群富含干细胞，在一定程度上可以代表干细胞。2004年，Kondo等［3］从C6、MCF7、B104和Hela 4个细胞系中检测到了SP细胞，并证实C6胶质瘤中的SP细胞具有自我更新、多向分化和少量成瘤的干细胞特性，提示SP细胞也是适用于肿瘤干细胞(tumor stem cell, TSC)分离的一种方法。之后，研究者又从神经母细胞瘤及其细胞系［4］、消化道恶性肿瘤细胞系［5］、甲状腺癌细胞系［6］等中成功分离出了SP细胞，并对SP细胞的干细胞特性及基因表达情况等进行了研究。因此越来越多的报道证明可以将SP细胞分离法用于对TSC的分离分析中。

胃癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤，国外有文献研究认为胃癌也应存在TSC，但由于缺乏有效明确的标记物，为胃癌干细胞的研究带来一定的困难。因此，本实验应用Hoechst33342染色结合荧光显微镜观察人胃癌BGC823细胞系中是否有干细胞样SP亚群的存在，从而为胃癌干细胞的分离研究提供新的思路。本研究结果显示，应用该法于荧光显微镜下观察到了该细胞系中存在SP亚群，且该表型细胞数量少，体积较小，与Goodell等的研究结果相符。且本实验还应用免疫荧光染色的方法通过原位观察证实了SP细胞表达干细胞标志物ABCG2。) r1 f/ o% s7 Z5 B% q6 [1 G# H
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ABCG2转运蛋白首先是从人乳腺癌肿瘤细胞中发现的［7］，但是作为干细胞表面标志目前也受到广泛关注。Zhou等［8］的研究发现利用逆转录病毒将Bcrp1基因（breast cancer resistance protein1基因，为ABCG2的同源基因）导入正常小鼠骨髓细胞，培养12天后，其中SP细胞的数量大增，约占细胞总数的60%，提示ABCG2的表达与SP表型相关。Zhou等［9］又证实了Bcrp1基因敲除的小鼠骨髓中SP组分显著减少，主要是SP细胞中Sca1 ckit  Lin-的组分，提示ABCG2和SP细胞的干细胞成分直接有关。国内有研究发现在胃癌细胞系MKN28中有ABCG2的阳性表达也有SP细胞的存在［10］，本实验通过免疫荧光定位法直接证明了ABCG2 的细胞即为SP表型的细胞，提示ABCG2的表达与SP表型直接相关。" v  c- F) _$ S

2001年，美国德州St. Jude儿童研究医院实验血液学部主任Brian Sorrentino博士领导的研究人员认为他们找到了世界上第一个“通用的”干细胞标记-ABCG2。因此，本实验初步证明人胃癌细胞系BGC823中不仅存在有SP亚群，且该亚群同样表达干细胞标志物，这就提示该胃癌细胞系中有胃癌干细胞的存在，而且可以将SP细胞分离法用于胃癌干细胞的分离研究中。7 Y' n9 I) M6 b# j
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相比之前利用细胞表面标志物通过流式细胞仪或免疫磁珠来分选TSC的方法，SP细胞分离法更为方便、经济。同时，由于SP细胞广泛的分布于各种组织器官中，又具有明确的表型标记和分离纯化方法，所以，该方法可以广泛的应用于各种组织来源的TSC的分离，尤其适用于目前尚无明确表面标志物的TSC分离研究，比如胃癌干细胞。由于缺乏有效明确的标记物，目前国内外尚无成功分离胃癌干细胞的报道。因此本实验通过证明胃癌细胞系中存有干细胞样的SP细胞，为胃癌干细胞的分离研究提供了新的思路和方法。
      【参考文献】
［1］ Goodell M A, Brose K, Paradis G, et al. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo［J］. J Exp Med, 1996, 183(4).
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