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作者：耿莉作者单位：山东大学齐鲁医院病理科， 济南 250012 6 w: f0 q/ |+ r- n
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【摘要】 目的 观察人胃癌BGC823肿瘤细胞系中是否含有SP细胞及SP细胞的形态特点，并验证该表型细胞与干细胞标志物(ABCG2)的关系。方法 取贴壁生长的BGC823细胞，经Hoechst33342染色，于荧光显微镜下观察细胞染色情况，并观察拒染或浅染的SP细胞的形态特点，计算其百分比；之后对细胞爬片进行Hoechst33342染色和ABCG2的免疫荧光染色，于荧光显微镜下观察Hoechst33342染色强度和ABCG2的表达情况。结果 荧光显微镜下可见BGC823细胞系中存在SP细胞，且该类细胞体积较小，约占细胞总数的1.8%；免疫荧光染色可见爬片细胞中ABCG2 细胞即为SP表型细胞。结论 人胃癌BGC823细胞系中存有SP细胞，且该表型细胞表达干细胞标志物ABCG2。 / `$ J1 a8 I8 s6 g0 |/ p
【关键词】胃肿瘤 肿瘤干细胞 侧群细胞
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GENG Li1， REN Ning2， DONG Wei3， YANG Yi4， LI Jinsong1
! \& J' P* Y; i1 \ W: g p9 D% |% p
3 `$ A4 j6 s7 g% F（1. Department of Pathology, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China;
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2. Department of Pathology, Jinan First People′s Hospital, Jinan 250011, China;! K: G, N1 h) O+ ?$ `- v
7 u& Q- \4 Q+ o8 o3. Department of Pathology, Weifang Traditional Chinese Medicine Hospital, Weifang 261041, Shandong, China; y4 i! ]2 T5 U: p6 ^& e4 c) w
0 D8 ^3 |; Y1 I) d4. Department of Pathology, Yankuang Group Hospital, Zoucheng 273500, Shandong, China）$ D% G! r* f4 S" L7 p' g2 \
9 E7 y! r0 S1 t) {9 ?3 STo explore side population (sp) phenotypes in the gastric cancer cell line BGC823 and to observe the morph of SP cells and the relationship between SP phenotype and stem cell marker ABCG2. MethodsAdherent BGC823 cells cultured in culture flasks were determined by fluorescence microscopy after being stained with Hoechst33342, and the percentage ofSP cells was determined. The adherent cells were mounted on a cover slip and stained with Hoechst 33342, and subsequently stained with mouse antihuman antibody and fluoresence antibody labeled by FITC. The staining of Hoechst33342 and expression of ABCG2 were determined by fluorescence microscopy. ResultsA SP phenotype was found in the BGC823 cell line, and it was small and occupied about 1.8% of all tumor cells, and SP cells could express the ABCG2 phenotype. ConclusionSP cells exist in the gastric cancer cell line BGC823 and can express the stem cell marker ABCG2.
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Key words:Gastric neoplasm； Tumor stem cell； Side population cells1996年Goodell等［1］1797首次用Hoechst33342染色于骨髓细胞中发现了一群染色很浅的细胞，称为侧群（side population，SP）细胞，其比例不到0.1%，体积较小，表达干细胞标志物（Sca1 Lin-/low）。之后也有研究证明SP细胞具有类似于干细胞的自我更新和多向分化潜能，在一定程度上可以代表干细胞。利用SP细胞外排荧光染料的特性，再结合流式细胞仪就可以将这其分离出来。最近，已有越来越多的研究者将SP细胞分离法用于对干细胞的分离分析中。胃癌是我国的高发恶性肿瘤之一，而目前国内外对胃癌干细胞的研究尚处于探索阶段。本研究旨在确定人胃癌BGC823肿瘤细胞株中是否存在SP细胞，并观察SP细胞的形态特点及其与干细胞标志物 (ATPbinding cassette superfamily G member 2 ，ABCG2)的关系，为进一步分离和研究胃癌干细胞提供线索和基础。1 z- ?, \: D# ~* v z+ f4 V
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1材料与方法
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1.1材料人胃癌细胞株BGC823（凯基生物），RPMI1640培养基（Gibco），标准胎牛血清（天津血液病研究所），胰蛋白酶（Amresco），Hoechst33342（Sigma），鼠抗人ABCG2抗体（R＆D System），FITC标记荧光二抗、3%H2O2、血清封闭液（中杉金桥公司）。
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1.2仪器CO2恒温细胞培养箱及恒温水浴箱（Heraeus），倒置显微镜(Olympus)，超净工作台(Air Tech)，超速离心机(Sigma)，荧光倒置显微镜(Leica)。
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1.3细胞培养人胃癌BGC823细胞株用含有10%胎牛血清、青霉素100?U/mL、链霉素100?μg/mL的1640培养基，于37?℃、5% CO2恒温培养箱中培养，根据细胞生长的速度及培养基的颜色更换培养基，一般为2?d 1次。用0.25%的胰蛋白酶消化传代，实验时用对数生长期的细胞。! B" W' P, @8 v+ i
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1.4荧光显微镜观察Hoechst 33342染色取对数生长期的BGC823细胞，弃去旧培养液，加入含有2鸖的1640培养液2?mL，再加入Hoechst33342至终浓度为5?μg/mL，37?℃避光孵育90?min。PBS冲洗2次，加入含2鸖的1640培养液1?mL，于倒置荧光显微镜下观察，SP细胞应为拒染或浅染的细胞。观察SP细胞的形态特点，并随机取5100视野，分别计数100个细胞，计算SP细胞所占比例。
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8 N- r! A& t% _9 }; b2 r5 G1.5免疫荧光检测细胞表面抗原ABCG2的表达按细胞传代的步骤将细胞冲洗、消化、吹打成细胞悬液，将细胞悬液滴加至六孔培养板中的盖玻片上，每孔轻轻补加培养液，放入培养箱中过夜。吸去孔中
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2结果
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& t/ }/ Y; ^, s3 z2 q$ v* G7 _2.1Hoechst 33342染色结果在紫外光激发下，于荧光显微镜下可见BGC823细胞株中大部分细胞胞核被Hoechst 33342染色呈现蓝色荧光，少部分细胞胞核蓝光较弱，在明视场下可见这些细胞的轮廓（图1）。这类细胞体积较小，即为SP细胞。计数BGC823细胞系中SP细胞约占细胞总数的1.8%。9 a" F; b7 ?+ Y+ ~/ Q
& R: b! w3 H/ n% [+ x* y1 u- l" e荧光显微镜下观察Hoechst33342浅染的BGC823细胞（200）4 \) E! J* T5 P' @( c
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2.2免疫荧光染色结果荧光显微镜下观察可见ABCG2表达阳性者，显示胞膜的绿色荧光，同一视野下用紫外激发光就可以发现，ABCG2 细胞即为Hoechst33342拒染或浅染的细胞，且细胞体积较小，即为SP细胞（图2）。图2荧光显微镜观察BGC823细胞中ABCG2 细胞（200）
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自1996年Goodell等［1］1806首次于骨髓细胞中发现具有干细胞特性的SP细胞后，研究者又从许多重要的其他组织器官中发现了SP细胞的存在，如骨骼肌、乳腺、肝、脑、肾等，证明SP细胞群比例从0.05%～3.6%不等，其表达干细胞标志物却不表达分化成熟的细胞表型，并具有干细胞特性，如参与了相应组织的更新与再生、器官系统的自我重建以及成体干细胞的多器官可塑性等［2］。这些研究都证明，SP细胞群富含干细胞，在一定程度上可以代表干细胞。2004年，Kondo等［3］从C6、MCF7、B104和Hela 4个细胞系中检测到了SP细胞，并证实C6胶质瘤中的SP细胞具有自我更新、多向分化和少量成瘤的干细胞特性，提示SP细胞也是适用于肿瘤干细胞(tumor stem cell, TSC)分离的一种方法。之后，研究者又从神经母细胞瘤及其细胞系［4］、消化道恶性肿瘤细胞系［5］、甲状腺癌细胞系［6］等中成功分离出了SP细胞，并对SP细胞的干细胞特性及基因表达情况等进行了研究。因此越来越多的报道证明可以将SP细胞分离法用于对TSC的分离分析中。
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3 [" y) S9 g6 z$ `" o8 b5 D胃癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤，国外有文献研究认为胃癌也应存在TSC，但由于缺乏有效明确的标记物，为胃癌干细胞的研究带来一定的困难。因此，本实验应用Hoechst33342染色结合荧光显微镜观察人胃癌BGC823细胞系中是否有干细胞样SP亚群的存在，从而为胃癌干细胞的分离研究提供新的思路。本研究结果显示，应用该法于荧光显微镜下观察到了该细胞系中存在SP亚群，且该表型细胞数量少，体积较小，与Goodell等的研究结果相符。且本实验还应用免疫荧光染色的方法通过原位观察证实了SP细胞表达干细胞标志物ABCG2。9 O( g: a8 p1 {" u3 @
' F) s3 a: T. s) B4 O1 @% |5 ^9 IABCG2转运蛋白首先是从人乳腺癌肿瘤细胞中发现的［7］，但是作为干细胞表面标志目前也受到广泛关注。Zhou等［8］的研究发现利用逆转录病毒将Bcrp1基因（breast cancer resistance protein1基因，为ABCG2的同源基因）导入正常小鼠骨髓细胞，培养12天后，其中SP细胞的数量大增，约占细胞总数的60%，提示ABCG2的表达与SP表型相关。Zhou等［9］又证实了Bcrp1基因敲除的小鼠骨髓中SP组分显著减少，主要是SP细胞中Sca1 ckit Lin-的组分，提示ABCG2和SP细胞的干细胞成分直接有关。国内有研究发现在胃癌细胞系MKN28中有ABCG2的阳性表达也有SP细胞的存在［10］，本实验通过免疫荧光定位法直接证明了ABCG2 的细胞即为SP表型的细胞，提示ABCG2的表达与SP表型直接相关。* s, d9 z; v& g+ J! C4 x$ E
+ q$ F, d& n7 U! W1 P' G+ J0 {2001年，美国德州St. Jude儿童研究医院实验血液学部主任Brian Sorrentino博士领导的研究人员认为他们找到了世界上第一个“通用的”干细胞标记-ABCG2。因此，本实验初步证明人胃癌细胞系BGC823中不仅存在有SP亚群，且该亚群同样表达干细胞标志物，这就提示该胃癌细胞系中有胃癌干细胞的存在，而且可以将SP细胞分离法用于胃癌干细胞的分离研究中。5 k3 Z" `' D, _: v
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相比之前利用细胞表面标志物通过流式细胞仪或免疫磁珠来分选TSC的方法，SP细胞分离法更为方便、经济。同时，由于SP细胞广泛的分布于各种组织器官中，又具有明确的表型标记和分离纯化方法，所以，该方法可以广泛的应用于各种组织来源的TSC的分离，尤其适用于目前尚无明确表面标志物的TSC分离研究，比如胃癌干细胞。由于缺乏有效明确的标记物，目前国内外尚无成功分离胃癌干细胞的报道。因此本实验通过证明胃癌细胞系中存有干细胞样的SP细胞，为胃癌干细胞的分离研究提供了新的思路和方法。* s4 B! C' C* b( v7 T0 m0 E. a; q
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