组织石蜡切片免疫荧光背景色过强，如何消除？

小白

" U: V' u0 n8 p: X
. r7 s$ y7 n9 X  R2 _具体步骤：
7 z8 h' s9 j; G* @8 {! L1.石蜡切片脱蜡复水，枸橼酸缓冲液热修复，pbs洗3次，每次5分钟5 n  \% Q8 |/ O/ K# D0 h
2.10%普通血清（1小时）或者1%BSA（半小时）封闭- i+ a5 H- m4 K0 ]0 @9 c. |
  ps.两种都试过，结果没有改善
: g. c0 F1 d' e! E! J: t% x3.加用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的一抗（1：100）
/ {4 S5 D1 r2 ^1 y4 c6 J  4℃湿盒过夜
. T) \8 A. Q$ L+ e$ z4.第二天洗掉一抗，PBS洗3次，每次5min
3 V' _( y. l: i. ]0 A/ q1 o加入用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的二抗（1：500），室温40min，避光
2 K( |' v8 ]: V8 Z9 e5 l5.PBS洗掉二抗，3次，每次5min. V, f. V6 F2 j" V1 L1 X& H
6.染核，PBS洗3次，每次5min: Y$ q# x9 _1 P# q: j- h, B
7.封片，荧光显微镜下观察4 l" {/ p* m( n7 p7 R
& O# v, z# m( s2 L- w
结果背景色很强，阴性对照（一抗换成PBS）也有很强的荧光，一抗是CK系列的抗体。
1 N7 |; X4 x# h0 v8 b请教哪些步骤需要改善？

starlancer

通常来说大公司的抗体都不会有问题的 所以还是要从操作上找原因 常见的几种背景过强的情况：1 脱蜡不彻底，石蜡在激发光下本身会发荧光 2 操作过程中样本干掉了，这样会导致背景很强 3.你用的是热修复或者微波修复法，这样的话在操作过程中如果修复过度可能会有很强的背景，至少比胰酶消化背景强 4.抗体出现问题，如二抗发生沉积，或者操作中渗入各种杂质等等。
1 k& P& I, L. z( t目前就想到这么多，建议楼主上图分析一下。

lichuang307

我也试试啊

fendou9

不加任何东西  石蜡切片还是会有荧光  这个是石蜡产生的   是很难消除的  脱蜡再好也不能完全消除

zhbshi998

分享了

djj01

是不是换用个其他方法再试试，如果自发荧光不能去除的话，可以适当消弱荧光起到对照效果就是了！

大笨鸟

谢谢分享

yueyongheng

楼主可以做一个不加一抗的对照试验，检测一下是不是二抗与切片发生了非特异性反应。
( `/ q2 e3 {" k2 x2 q! G另外不解为什么楼主不用PBS/T洗片

cortex

有阴性对照，就成了，你可以把荧光调弱，去处背景荧光就可以了啊。染上色之后，与背景荧光差异很大的。

小白

" _- o) ]" F3 }6 k" u) w" R

你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。
2 M  u/ V( v# p, C' Y$ `- M8 x/ ^可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以 ...
& i+ m7 Q0 ]- P. u+ drunsong 发表于 2010-7-18 14:27

; s9 P! f7 U1 ^我试过没做任何染色步骤的切片（未脱蜡）在荧光显微镜下面看，就是有自发荧光的，跟阴性对照的强度看起来差不多