组织石蜡切片免疫荧光背景色过强，如何消除？

小白

; V6 Q) H0 i' o0 J& \+ }

8 `' W3 ^# N8 h具体步骤：3 N8 X8 V5 h& d. I
1.石蜡切片脱蜡复水，枸橼酸缓冲液热修复，pbs洗3次，每次5分钟
, \0 u1 M* ]( _* C, V2.10%普通血清（1小时）或者1%BSA（半小时）封闭9 {( e+ w9 E& j' t; Q! r2 i
  ps.两种都试过，结果没有改善
1 x: }0 l" d  L; J6 v5 ~4 Y# ]0 Q3 Y) a, w3.加用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的一抗（1：100）
1 h' }2 v1 i3 z; o+ L  {4 \  4℃湿盒过夜7 l; L* }' w' D5 W
4.第二天洗掉一抗，PBS洗3次，每次5min' ?& b, K) i% j1 i! T4 P
加入用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的二抗（1：500），室温40min，避光
( D: f, B0 `- [0 D7 E7 {5.PBS洗掉二抗，3次，每次5min8 Z9 D" k. d7 }
6.染核，PBS洗3次，每次5min
5 X8 s0 z- ^# k1 \% A* c7.封片，荧光显微镜下观察
- l9 W/ V: v1 \+ V- `3 u
% [9 v! Y6 \2 B# T5 F- _5 ?+ y结果背景色很强，阴性对照（一抗换成PBS）也有很强的荧光，一抗是CK系列的抗体。1 Y. L7 Y3 I# z4 z/ A& _' \9 L
请教哪些步骤需要改善？

淡定

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试

小白

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试1 r7 g2 `1 n( x
淡定 发表于 2010-7-16 13:05

% Q0 j3 ], U2 A9 o: @& g试一试，谢谢！

runsong

abbr_f0f3f63a5a3344da325045ba02d05b53.pdf (567.61 KB)

2010-7-18 14:26 上传

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你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。
; C, ~; n- K) M& N% E可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以用的。
( ~. r5 `- f9 I+ M3 Q文章中第十页的图片背景染色也有，有差异就行。

runsong

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。

小白

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。
2 @5 q+ C+ R' J4 w5 brunsong 发表于 2010-7-18 14:35

' q% {7 _, B& v0 n9 \# C
不是专业做切片的，只是实验里面荧光染色的部分涉及的比较多

小白

1 p: S$ m# [0 U* U3 t5 t7 A6 h

你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。
  m0 F, [3 F4 C! X可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以 .... T  f* c: N5 U; h' k' r# O
runsong 发表于 2010-7-18 14:27

# l# Q6 D/ _7 l# h
我试过没做任何染色步骤的切片（未脱蜡）在荧光显微镜下面看，就是有自发荧光的，跟阴性对照的强度看起来差不多

cortex

有阴性对照，就成了，你可以把荧光调弱，去处背景荧光就可以了啊。染上色之后，与背景荧光差异很大的。

yueyongheng

楼主可以做一个不加一抗的对照试验，检测一下是不是二抗与切片发生了非特异性反应。
) O  y% K( p1 p1 E% \! T另外不解为什么楼主不用PBS/T洗片

大笨鸟

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