组织石蜡切片免疫荧光背景色过强，如何消除？

小白

, w) O4 n" U0 P4 N' J7 q1 [8 n

6 ~0 i) O4 A0 ?具体步骤：8 w* y0 K( ^. ]
1.石蜡切片脱蜡复水，枸橼酸缓冲液热修复，pbs洗3次，每次5分钟3 m5 R: P9 v% F! Q! g# r. p. ^) d
2.10%普通血清（1小时）或者1%BSA（半小时）封闭
# C) Z8 w  [) c6 V- T$ E  ps.两种都试过，结果没有改善
, T5 u' W3 w  I. b: U4 ], P3.加用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的一抗（1：100）+ c/ A" k, v- `( Y: e
  4℃湿盒过夜
9 G$ k8 p7 z# {7 W1 K  I9 V4.第二天洗掉一抗，PBS洗3次，每次5min
5 ]3 U& ~9 \* d5 V加入用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的二抗（1：500），室温40min，避光
9 v) r, @% {  \1 p0 h' _5.PBS洗掉二抗，3次，每次5min! x5 c6 j1 v7 U, m
6.染核，PBS洗3次，每次5min  k: }$ ]% a, v2 v2 [; O
7.封片，荧光显微镜下观察
) R1 Y( }' X9 W) [  M5 ^1 [' J/ U6 D' w4 K0 a) F
结果背景色很强，阴性对照（一抗换成PBS）也有很强的荧光，一抗是CK系列的抗体。( ~* i* S% @: u! W
请教哪些步骤需要改善？

淡定

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试

小白

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试
, S3 A' x3 y8 Q, h  j* \淡定 发表于 2010-7-16 13:05

. @; d7 G7 n! T% D) b- s4 n
试一试，谢谢！

runsong

abbr_f0f3f63a5a3344da325045ba02d05b53.pdf (567.61 KB)

2010-7-18 14:26 上传

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你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。) U$ p+ T, I0 f: m1 W
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以用的。
( u/ {: s3 ^1 T8 S. V, ]文章中第十页的图片背景染色也有，有差异就行。

runsong

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。

小白

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。
" f- K9 Q: y1 d3 o8 S( Orunsong 发表于 2010-7-18 14:35

* N, u, p: P2 [; Q& U# o
不是专业做切片的，只是实验里面荧光染色的部分涉及的比较多

小白

+ O" u4 Q5 l  G2 k. m0 c. `; C$ _

你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。
! S9 N: w6 p0 j% z' A* M可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以 ...
; T2 n3 b; Y/ c" @& Lrunsong 发表于 2010-7-18 14:27

) V0 ~& M, S6 Q) R& y
我试过没做任何染色步骤的切片（未脱蜡）在荧光显微镜下面看，就是有自发荧光的，跟阴性对照的强度看起来差不多

cortex

有阴性对照，就成了，你可以把荧光调弱，去处背景荧光就可以了啊。染上色之后，与背景荧光差异很大的。

yueyongheng

楼主可以做一个不加一抗的对照试验，检测一下是不是二抗与切片发生了非特异性反应。$ |% X2 o9 Q# ]/ H. C
另外不解为什么楼主不用PBS/T洗片

大笨鸟

谢谢分享