组织石蜡切片免疫荧光背景色过强，如何消除？

小白

1 u5 T1 S( o4 Z; O5 ]! Q! P- v4 v5 e& ]$ d, e; O2 q  l
具体步骤：
' j1 o6 B( f( r6 l8 r) d7 u) p1.石蜡切片脱蜡复水，枸橼酸缓冲液热修复，pbs洗3次，每次5分钟
1 e1 o: H, ]/ ~% f2.10%普通血清（1小时）或者1%BSA（半小时）封闭, E' K: I5 t8 N; Z; w
  ps.两种都试过，结果没有改善
3 Q9 U; n/ T2 u* e3.加用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的一抗（1：100）
( w, n6 l+ x' T2 g% Q: h7 C$ j3 J  4℃湿盒过夜
1 _3 `0 `8 h5 F5 H/ s* r4.第二天洗掉一抗，PBS洗3次，每次5min
) J0 Q5 O1 Y! `, [+ d加入用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的二抗（1：500），室温40min，避光6 U# u) [0 ]$ {9 j% T
5.PBS洗掉二抗，3次，每次5min/ G# T; X' u7 O0 s; ]9 Y
6.染核，PBS洗3次，每次5min
0 N1 V1 C/ ], `! f% I, P7.封片，荧光显微镜下观察
8 V" T% ?0 H- U. o, T$ q& H: _( A
结果背景色很强，阴性对照（一抗换成PBS）也有很强的荧光，一抗是CK系列的抗体。
  h; l& c  Z2 ~7 X请教哪些步骤需要改善？

starlancer

通常来说大公司的抗体都不会有问题的 所以还是要从操作上找原因 常见的几种背景过强的情况：1 脱蜡不彻底，石蜡在激发光下本身会发荧光 2 操作过程中样本干掉了，这样会导致背景很强 3.你用的是热修复或者微波修复法，这样的话在操作过程中如果修复过度可能会有很强的背景，至少比胰酶消化背景强 4.抗体出现问题，如二抗发生沉积，或者操作中渗入各种杂质等等。, J4 a$ g- o8 Y: ~/ K
目前就想到这么多，建议楼主上图分析一下。

lichuang307

我也试试啊

fendou9

不加任何东西  石蜡切片还是会有荧光  这个是石蜡产生的   是很难消除的  脱蜡再好也不能完全消除

zhbshi998

分享了

djj01

是不是换用个其他方法再试试，如果自发荧光不能去除的话，可以适当消弱荧光起到对照效果就是了！

大笨鸟

谢谢分享

yueyongheng

楼主可以做一个不加一抗的对照试验，检测一下是不是二抗与切片发生了非特异性反应。7 O: A! N+ z9 D, y
另外不解为什么楼主不用PBS/T洗片

cortex

有阴性对照，就成了，你可以把荧光调弱，去处背景荧光就可以了啊。染上色之后，与背景荧光差异很大的。

小白

, @) o; w4 D$ h4 b9 ?  ]& U. D

你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。% ?7 l1 Z- \$ O" X$ t* u: B9 }
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以 ...
/ I+ k% U6 I- Srunsong 发表于 2010-7-18 14:27

9 ?/ p+ \. G8 }9 N我试过没做任何染色步骤的切片（未脱蜡）在荧光显微镜下面看，就是有自发荧光的，跟阴性对照的强度看起来差不多