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作者：熊咏*，田美玲，秦建兵，朱蕙霞，金国华**作者单位：南通大学医学院 人体解剖学教研室，生物化学教研室，神经生物学研究所， 南通 226001
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【摘要】 目的：探讨大鼠胚脑皮层和隔区神经干细胞在NGF的诱导下分化为神经元和AChE阳性神经元的情况。方法：应用无血清培养技术，分别从SD大鼠胚脑皮层和隔区分离克隆神经干细胞，然后在含或不含NGF的培养液中分化14d。用MAP-2免疫荧光和AChE组化技术检测神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元的情况。并对MAP-2阳性神经元的分化率、AChE阳性神经元数及其它们的细胞面积和周长进行图像处理；用STATA 7.0统计软件进行方差分析和两两比较。结果：隔区和皮层NGF组MAP-2阳性神经元分化率高于隔区和皮层对照组；其细胞面积除隔区NGF组与皮层NGF组之外，其它各组间差异均有统计学意义；而其周长各组之间差异均有统计学意义。AChE阳性神经元的数量及细胞面积和周长，隔区NGF组最佳，皮层NGF组次之，隔区对照组再次之，皮层对照组较差。三项指标各组间差异有统计学意义。结论：NGF可诱导大鼠胚脑皮层和隔区神经干细胞向神经元分化；隔区神经干细胞较皮层神经干细胞更易于向AChE阳性神经元分化；这种区域特异性可在NGF诱导下发生改变。
, b. S6 H) x7 D( J# j 【关键词】神经生长因子；神经干细胞；AChE阳性神经元；免疫组织化学法；大鼠
+ z9 W! Y1 V# C- M% ] 如何诱导神经干细胞向特定（目的）神经元分化是当今神经科学领域尚未解决的难题。神经干细胞的分化受细胞内在基因[1]、生长因子或细胞因子[2，3]及所处微环境[4]等因素的调控。神经生长因子（nerve growth factor, NGF）是发现最早、研究最为广泛和深入的一种神经营养因子，它不仅影响交感和感觉神经元的发育与存活，在胚胎期它还可以促进包括隔区在内的基底前脑胆碱能神经元的存活和发育。而NGF在神经干细胞向神经元或胆碱能神经元诱导分化方面是否也有作用，则鲜见报道。本研究分别从SD大鼠胚脑皮层和隔区分离克隆神经干细胞，然后用NGF诱导分化，通过MAP-2免疫荧光、AChE组织化学和图像处理等手段，检测神经干细胞分化为神经元和胆碱能神经元的情况。
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6 I# m/ U3 ~7 [7 W9 o" h% B$ B 1材料和方法
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6 B! }. ^( U) q$ c5 v' g: W& s 1.1鼠胚皮层和隔区神经干细胞的分离培养及鉴定: H6 r5 T5 c* o0 M
& _9 J$ b( I/ |0 O) q 1.1.1鼠胚皮层和隔区神经干细胞的分离和原代克隆取孕17d SD大鼠，腹腔注射复合麻醉剂chlorpent 0.2ml/100g体重，取出胚鼠放入无血清培养基中，分别取出皮层和隔区原基，剔除脑膜、脉络膜及血管等。然后按照田美玲等[5]报道的方法进行分离和原代克隆实验。
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/ }' |0 }% u7 A% b' }( y 1.1.2胚皮层和隔区神经干细胞的单克隆、传代和扩增将从原代克隆实验中分别获得的皮层和隔区神经干细胞球消化后，进行单克隆、传代和扩增。8 e8 a n2 A0 E0 K3 W9 J
8 }8 {2 S0 W3 a# [ 1.1.3胚皮层和隔区神经干细胞的检测为了验证所获取的胚皮层和隔区神经干细胞具有胚胎源性、增殖特性和多分化潜能，分别将单克隆后传至第2代的皮层和隔区的神经干细胞球进行Nestin免疫荧光检测、BrdU标记及免疫荧光检测和MAP-2、GFAP、CNP的免疫荧光检测。
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0 d: ?/ D' b: S9 c' A8 D! S2 v) n 1.2NGF诱导皮层和隔区神经干细胞的分化将单克隆后传至第3代的皮层和隔区的神经干细胞球接种至培养板中，每孔接种10个神经干细胞球左右，每组接种12孔，每块板各6孔：（1）皮层对照组：接种皮层神经干细胞球，加含10%胎牛血清（FBS）、DMEM/F12（1∶1）的分化培养液；（2）皮层NGF组：接种皮层神经干细胞球，加含100ng/ml NGF的上述分化培养液；（3）隔区对照组：接种隔区神经干细胞球，加与皮层对照组相同的分化培养液；（4）隔区NGF组：接种隔区神经干细胞球，加与皮层NGF组相同的分化培养液。- E% j$ E/ s8 J' t
9 E7 F# R- T7 z 1.3MAP-2免疫荧光和AChE组化染色
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; \! P% p e) W9 I/ h4 ` 1.3.1MAP-2 免疫荧光检测细胞经4%多聚甲醛固定，PBS淡涤后加入10%山羊血清封闭液封闭，一抗为MAP-2单抗（1∶200）（Chemicon公司）4℃ 72h，二抗为FITC-标记的羊抗鼠IgG（1∶100）
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- {: V8 F" c# ]% ~" M- ~3 k 1.3.2AChE组织化学染色参照Tago等[11]的方法进行AChE组化染色。0 R- T" Y3 ?, ^9 n) N+ U% r& S
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1.4细胞计数、图像处理和统计学分析每张玻片在放大200倍的情况下，随机取4个视野，用数码相机将免疫荧光片中荧光激发状态和非激发状态下明视场的图像，以及AChE组化染色切片的照片输入计算机中，计数各组每张玻片中4个视野内的MAP-2阳性神经元数和同一视野内明视场下的总细胞数，两者相除得到MAP-2阳性神经元的分化率；同样计数AChE组化染色4个视野内的AChE阳性神经元数。4个视野内的平均值则为该玻片的数据。并应用捷达801系列形态学分析系统软件分别对MAP-2和AChE阳性神经元的细胞面积、细胞周长进行图像处理，其平均值作为该玻片的数据。用STATA 7.0统计软件对4组MAP-2阳性神经元的分化率、AChE阳性神经元数，以及MAP-2和AChE阳性神经元的细胞面积和周长分别进行方差分析和组间比较。
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2结果
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* j, Q. ~! m; ]2 W 2.1NGF诱导胚皮层和隔区神经干细胞分化MAP-2免疫荧光检测、图像处理和统计结果诱导分化14 d后， 隔区NGF组中的MAP-2阳性神经元最多、胞体最大，突起最丰富（见封三图1），皮层NGF组次之（见封三图2），而隔区对照组（见封三图3）及皮层对照组（见封三图4）中的MAP-2阳性神经元数量则较少，胞体较小，突起也较少。4组MAP-2阳性神经元的分化率、细胞面积和周长及方差分析结果见表1。两两比较结果表明，MAP-2阳性神经元分化率皮层对照组与隔区对照组之间、皮层NGF组与隔区NGF组之间差异无统计学意义（P＞0.05），但所有的对照组与NGF组之间差异有统计学意义（P
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- A9 r7 B; R/ ~) {* Y" a9 v 2.2AChE组化检测、图像处理和统计结果分化诱导14 d后，隔区NGF组中AChE阳性神经元最多、细胞最大，突起也最丰富（见封三图5）；皮层NGF组中AChE阳性神经元的数较多，胞体较大，突起也较丰富（见封三图6）；隔区对照组中AChE阳性神经元的数量、胞体大小和周长则要明显地差于上述两组（见封三图7），而皮层对照组上述指标则最差（见封三图8）。4组AChE阳性神经元数、细胞面积和细胞周长的数据及方差分析结果详见表2。两两比较结果表明，上述三项指标各组间差异均有统计学意义（P均! h7 c/ I I$ ]9 ]8 y, m
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3讨论0 H" P ^( h8 i) V
" E/ k- I! Q" D K2 w. w4 U: O: a NGF不仅参与了神经系统的发育，而且还影响免疫、造血、内分泌和生殖等非神经系统的功能[6]。在神经系统发育期，NGF能诱导神经纤维的定向生长、控制神经元的存活数量、刺激胞体和树突的发育，影响神经纤维支配靶区的密度以及促进神经元的分化等[7]。在基底前脑胆碱能神经元的发育和分化方面，NGF可以调节基底前脑胆碱能神经元突触前膜上胆碱高亲和摄取系统的发育和促进胆碱乙酰转移酶的合成[6]。NGF还可以保护轴突受损的胆碱能神经元免于死亡[8]。
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4 n/ V- @! Q! L5 T3 I: X 本实验研究结果发现，皮层和隔区来源的神经干细胞在分化为MAP-2阳性神经元的数量方面无明显的区别，但在应用NGF诱导后，两个部位来源的神经干细胞分化为MAP-2阳性神经元的数量均大大地增加，显示不出NGF对两个不同部位来源神经干细胞诱导作用的强弱。用细胞面积和周长反映分化细胞成熟度的指标，在没有NGF诱导的情况下，隔区来源的神经干细胞分化为MAP-2阳性神经元的成熟度要好于皮层来源神经干细胞分化为MAP-2阳性神经元的成熟度。但在NGF的诱导下，这种差别就不明显了。Calza等[9]在损毁基底前脑胆碱能神经元后，于侧脑室注射EGF和bFGF 14 d后，再改用NGF注射14 d，结果除发现基底前脑胆碱能神经元受损大鼠的学习记忆功能得到明显改善外，形态学也证实脑内海马等处有较多的神经干细胞被NGF诱导分化为胆碱能神经元。本实验结果发现NGF可诱导皮层和隔区来源的神经干细胞向成熟的AChE阳性的胆碱能神经元分化。且隔区来源的神经干细胞比皮层来源的神经干细胞更易于向AChE阳性神经元分化，这可能是因为隔区来源的神经干细胞具有更易于向胆碱能神经元分化的区域特异性。有关神经干细胞分化的区域特异性，在神经干细胞向多巴胺神经元分化中的研究较多，而在神经干细胞向胆碱能神经元分化中的研究较少。本实验结果不但证明神经干细胞向胆碱能神经元分化具有区域特异性，还提示在NGF的诱导下，不仅隔区来源的神经干细胞可以更多地向成熟的胆碱能神经元分化，而在通常情况下较少地分化为胆碱能神经元的皮层来源的神经干细胞也较多地分化成了形态上比较成熟的胆碱能神经元。说明神经干细胞分化为胆碱能神经元的区域特异性可以在某些因素的诱导下而发生改变。本实验的结果也进一步验证了Hitoshi[10]神经干细胞分化的区域特异性可被诱导而改变的观点。 `+ ~6 Z- Z; Q; F" {
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