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作者：王 宾 沈来根 朱越锋 李鲁滨 郭治宇 刘振杰作者单位：322100 浙江省东阳市人民医院 310016 浙江大学附属邵逸夫医院 324000 浙江省金华市中心医院 200000 复旦大学附属中山医院在读博士
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【摘要】 目的 培养和鉴定兔骨髓间充质干细胞,基因转染后观察hVEGF165在其中的表达。 方法 体外培养兔骨髓间充质干细胞,以流式细胞仪检测其表面抗原(CD29、CD44、CD45、HLA-DR)的表达。通过腺病毒载体转染hVEGF165后,采用RT-PCR、Western blot法检测hVEGF165在细胞中的表达。 结果 通过流式细胞仪检测表明培养的细胞为兔骨髓间充质干细胞, RT-PCR法、Western blot法检测结果均表明hVEGF165基因转染兔骨髓间充质干细胞后能在其中表达。 结论 成功培养兔体外骨髓间充质干细胞, 基因转染后细胞能有效表达hVEGF165。 + |9 x" }5 ]9 i) a7 [/ \* N
【关键词】目的 培养和鉴定兔骨髓间充质干细胞,基因转染后观察hVEGF165在其中的表达。 方法 体外培养兔骨髓间充质干细胞,以流式细胞仪检测其表面抗原(CD29、CD44、CD45、HLA-DR)的表达。通过腺病毒载体转染hVEGF165后,采用RT-PCR、Western blot法检测hVEGF165在细胞中的表达。 结果 通过流式细胞仪检测表明培养的细胞为兔骨髓间充质干细胞, RT-PCR法、Western blot法检测结果均表明hVEGF165基因转染兔骨髓间充质干细胞后能在其中表达。 结论 成功培养兔体外骨髓间充质干细胞, 基因转染后细胞能有效表达hVEGF165。
0 T$ Q" h" c" [; N6 b 【Abstract】ObjectiveTo cultivate and accredit rabbit mesenchymal stem cells ,and to detect the expression of hVEGF165 after gene transfection. MethodsRabbit mesenchymal stem cells was accredited expression of antigen CD29、CD44、CD45、HLA-DR after cultivated in vitro. The constructed plasmids containing right sequence of hVEGF165 were transfected into rabbit mesenchymal stem cells by adenovirus.The expression of hVEGF165 was tested by RT-PCR and western-blot. ResultsThe expression of antigen of cells indicated the cells were rabbit mesenchymal stem cells. The results of RT-PCR and western-blot showed that the transfected cells could express hVEGF165. ConclusionThe rabbit mesenchymal stem cells can successfully express hVEGF165 after gene transfection.6 r- U) ~8 G) O0 q5 a$ D! {# y
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【Key words】mesenchymal stem cellsvascular endothelial growth factor ( VEGF)gene transfection, expression$ u6 H8 d5 d- r# T$ I* B% h% M
; c: o% |" T7 P4 W& H1 x5 e2 ~5 l0 W 骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一种具有多向分化潜能的细胞，可分化成多种间质细胞，如成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，也可分化成神经系统的神经元细胞、神经胶质细胞和脉管系统的血管内皮细胞,成为近年来基因组织工程研究的热点。血管内皮生长因子(VEGF) 是一种高特异性的内皮细胞有丝分裂原, 能促进血管内皮细胞分裂、增殖, 形成新血管［１］。本研究通过体外培养兔骨髓间充质干细胞,用基因转染技术将VEGF基因导入细胞, 观察其在细胞中的表达。在此基础上可将骨髓间充质干细胞与VEGF结合植入缺血区, 通过MSCs与VEGF的双重作用, 来促进局部血管增生,治疗慢性缺血性疾病。
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1材料与方法
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( |7 b1 w# R4 f" c+ f" P7 R 1.1材料(1)细胞和腺病毒:兔骨髓间充质干细胞自行培养和鉴定,含hVEGF165的非扩增型腺病毒和含GFP的非扩增型腺病毒购自上海生物基因科技发展有限公司。(2)主要试剂：DMEM培养液和淋巴细胞分离液购于上海生物有限公司；胰酶购自杭州公司; TRIZOL购自Sigma公司;mRNA逆转录酶（M-MLV）购于Promega公司；蛋白裂解液购自Satancruz公司;羊抗人hVEGF165单克隆抗体购于Sigma公司;兔抗山羊二抗购于北京公司;ECL化学发光试剂购自联科生物公司;R－Phycoerythrin（R-PE）标记的鼠抗人HLA-DR的单克隆抗体购于BDBioscience公司,可跟兔交叉反应;鼠抗兔CD44、CD45单克隆抗体购于Serotec公司，鼠抗人CD29单克隆抗体购于Chemicon公司,可跟兔CD29交叉反应。(3)RT-PCR引物设计和合成 根据GeneBank中登录的目的基因序列,以引物设计软件Primer Express2.0辅助自行设计引物, 上游引物5′-TCT GCT GTC TTG GGT GCA TTG-3′ 下游引物5′-ATG GCA GTA GCT GCG CTG ATA G-3′,目的片断为150bp,引物由上海公司合成。, ~ [, x6 x. m5 t
. Y9 ]0 g' Y, _$ \0 X0 | 1.2方法(1)MSCs分离与培养：无菌操作从兔胫骨抽取骨髓3ml，与等体积DMEM培养液（含16％胎牛血清）混合后，铺于6ml的淋巴细胞分离液之上，离心（2500r/min）25min，取中层单个核细胞，置于含DMEM液的细胞培养瓶中，在温度37℃，含5％CO2饱和湿度的培养箱中培养，24h后首次换液，以后每5d换液一次。经不断增殖培养至细胞数达107用于鉴定或转染。(2)MSCs的鉴定：取生长状态良好的细胞，自第3代至第6代，采用流式细胞仪对MSCs表面抗原CD29、CD44、CD45、HLA-DR的表达进行检测。抗体分别是R-PE标记的鼠抗人B细胞HLA-DR的单克隆抗体、鼠抗兔T细胞CD44、CD45单克隆抗体、鼠抗人CD29单克隆抗体。后三种一抗均与Rhodamine标记的山羊抗鼠二抗结合后流式细胞仪检测。(3)VEGF转染MSCs：MSCs培养至107后，向培养瓶中加入含hVEGF165的非扩增型腺病毒，共同培养48h后以胰酶消化制成单细胞悬液供移植用。同时取部分细胞在相同条件下加入含GFP的非扩增型腺病毒，48h后在荧光显微镜下测定其转染率。(4)总RNA 的提取及RT-PCR 扩增: 转染后得到的表达hVEGF165的MSCs,同时设hVEGF165质粒为阳性对照,转GFP的MSCs为阴性对照,用TRIZOL常规提取总RNA ,经逆转录合成cDNA 进行PCR 反应。采用高保真Taq NA聚合酶进行PCR扩增,扩增条件为95℃预变性5min,94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,扩增30个循环, 最后72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离,鉴定目的片段的表达。(5)Western-blot鉴定目的蛋白的表达:转染后得到的表达hVEGF165的MSCs,同时设转GFP的MSCs为对照。常规方法提取细胞全蛋白,取50μg蛋白,与2SampleBuffer1∶1混匀后煮沸10min,10%SDS2聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳,然后电转移至PVDF膜(Millipore,孔径0.45μm,USA),用含5%脱脂奶粉的TBS封闭2 h,加羊抗人VEGF抗体(1∶500)4℃反应过夜,然后与偶联辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG(1∶5000) 室温反应2h,每步反应结束均用含0.05% Tween-20的TBS洗涤3次,每次10min,最后用ECL液显色,X片曝光。
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: }4 v* @$ }$ P; z" A0 j 2结果
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2.1原代MSCs 24h后即出现贴壁细胞，以后细胞呈克隆样生长。经传代后细胞生长加快，呈现梭形形态（图1）。
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2.2MSCs的鉴定各抗原表达如下(表1,图2)- z; c3 l6 D P0 {
1 e7 [/ F6 P. e7 _7 A 表1MSCs表面抗原CD29、CD44、CD45、HLA-DR表达 略
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: O$ j0 ~) |( @5 J0 S% H 2.3VEGF转染MSCs转染hVEGF165及GFP后未见细胞死亡，48h后在荧光显微镜下可见强荧光表达，转染率近100%（图3）。; \* C( C- w3 @
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2.4RT-PCR检测结果hVEGF165质粒和转染hVEGF165的MSCs的RT-PCR扩增产物可见目的基因条带(图4),而转染GFP的MSCs扩增未见条带。2 a$ |& [* U8 @9 H3 [
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" a2 T: O, W; `0 a; W8 u! X 2.5Western blot结果转染hVEGF165的MSCs提取的蛋白,分别在23kD处有一条明显阳性杂交带, 而转染GFP的MSCs提取蛋白未见阳性条带(图5),这表明转染目的基因的细胞表达VEGF蛋白。* `0 j% E# q5 F/ {
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图348h后荧光显微镜观测转染携带GFP的非扩增型腺病毒的干细胞；略! [" ?' B6 O: a
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图4RT-PCR产物电泳图(略)
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! D& |: S# q8 L8 ] 图5转染后细胞提取蛋白Western blot结果(略)
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4 w# F2 t% c) v% v& c 3讨论
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( {, V j: m% s# k- ^1 p+ h 干细胞移植，在基础领域和临床研究中均取得了一系列成果，其中多以造血干细胞为研究对象［２］。而MSCs在体外可以通过贴壁培养加以分离，分裂增殖能力强。由于存在骨髓中，采集方便，对机体损伤小。可以向多种结缔组织细胞分化，并易于被外源基因转染且稳定表达，因此被认为是组织工程、细胞及基因治疗理想的靶细胞。1 e+ @8 j1 H8 o$ W* [
6 h/ U. Y7 u* h# |! M7 l* n' d MSCs具有特征性的表面标志。特点是不表达CD34（造血干细胞及内皮细胞呈阳性）、CD45（白细胞呈阳性）、HLA-DR（抗原呈递细胞及成纤维细胞呈阳性）；而表达CD29、CD44、CD105、CD166等MSCs特异性表面抗原标记［３］。 流式细胞仪检测结果显示所培养细胞的表面抗原CD29、CD44有阳性表达，而CD45、 HLA-DR是阴性表达。说明所培养的细胞不是骨髓中的另1大类细胞-造血干细胞，而是骨髓的间充质细胞。
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VEGF［４］是一种特异性的与血管生长有关的生长因子，在缺血等病理条件下VEGF及其受体表达明显上调，参与血管再生机制及侧支循环的形成。其主要生物学效应是与内皮细胞表面的特异性受体结合, 促进血管内皮细胞发生分裂和增殖［１］,尤其VEGF165的促血管作用最明显［５］。目前研究多采用VEGF基因或VEGF构建的质粒/缺陷腺病毒直接注射的方法，但存在表达时间短，局部水肿［６］的问题。而采用VEGF转染MSCs，再进行细胞移植，有可能使MSCs持续表达VEGF，增加VEGF的表达。
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今后拟将MSCs与VEGF相结合,在局部组织缺血时通过自分泌和旁分泌途径, 提供足量的促进血管生长的生长因子, 以促进其自身及内皮细胞增殖分化及血管的形成, 为基因生物工程治疗缺血性疾病提供实验基础。6 }1 ]* [& s* }2 }
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