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作者：罗敏，周媛，宫卫东，周思朗，张婧，张积仁作者单位： 1南方医科大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282 8 L: }. @! A: d. f& _
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【摘要】 目的： 应用SRB法探讨不同药物对骨髓间充质干细胞（MSCs）、肝癌细胞(HC)和HepG2细胞的药敏差异. 方法： 雌性清洁级SD大鼠20只，应用二乙基亚硝胺饲喂法建立大鼠原发性肝癌模型，选取诱癌成功大鼠8只分别原代培养HC与MSCs，同时培养HepG2细胞系细胞，SRB法进行药物敏感实验，观察药物敏感性的差异. 结果： 对阿霉素、顺铂、洛拉曲克的敏感度从高到低依次为HepG2细胞,HC,MSCs. 而丝裂霉素药敏显示，3种细胞药物敏感度从高到低依次为HepG2,MSCs, HC. 结论：HC药敏实验与HepG2细胞和MSCs存在一定异同. - a' M4 z( N; o, q7 U, K# M/ A: W
【关键词】肝肿瘤；肿瘤干细胞；间质干细胞；SRB药物敏感实验
$ ~ _( h1 `. K* B) G1 K2 j3 M+ \6 f 原发性肝癌细胞中也存在类似于其他实体瘤肿瘤干细胞的强增殖性细胞亚群，其在表面标志、耐药性、强增殖性等方面与骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells, MSCs）存在相同点［1］. 而细胞系则被认为是不同于肿瘤干细胞的永生化细胞. 我们使用二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine, DEN）制备大鼠原发性肝癌模型，应用SRB法药物敏感实验检测抗肝癌药物（阿霉素、顺铂、丝裂霉素、洛拉曲克）对肝癌细胞（hepatocarcinoma cells，HC）, MSCs和HepG2细胞杀伤作用，为探讨耐药机制不同的细胞特征差异提供新的线索.
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0 E2 f! E% N3 O7 I) X 1材料和方法6 f+ z3 E$ h5 }* e
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1.1材料
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雄性清洁级SD大鼠20只，鼠龄8 wk，体质量（102.7±10.2）g，由南方医科大学动物实验中心提供;HepG2细胞由广东省人民医院肿瘤科惠赠; LDMEM，RPMI1640，胎牛血清为杭州四季青产品;SRB，DEN为美国Sigma公司产品;阿霉素(规格: 10 mg/ 支) 为浙江海正药业股份有限公司产品；顺铂（规格: 10 mg/瓶）为山东齐鲁药业股份有限公司产品；丝裂霉素为浙江海正制药厂产品；洛拉曲克（nolatrexed dihydrochloride, AG337）为北京康辰医药发展有限公司产品.2 U3 P( a/ n: }6 x' B6 n/ M
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1.2方法" O1 Q( R+ W0 E1 c+ A; v
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采用DEN诱发大鼠肝癌模型，即用0.25 g/L DEN水溶液为诱癌剂，放在水中大鼠自由饮水. 12～16 wk后选取诱癌成功的大鼠8只进行实验. 将大鼠处死，750 mL/L乙醇浸泡3 min. 无菌条件下剥离肿瘤，取肝癌组织约1 g，置于含500 U/L青霉素, 500 g/L链霉素的无菌PBS液中. 切取无坏死肝癌组织块，用Hank液漂洗2次，剪碎为0.5 mm3~1 mm3，放入25 mL培养瓶贴壁，加少量含200 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液. 翻置25 mL培养瓶，50 mL/L CO2, 37℃恒温箱中培养2~3 h. 再次翻转，加足量含200 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液. 根据培养液改变情况2~3 d换液. 同只大鼠在HC原代培养取材后，无菌条件下分离股骨胫骨，咬去骨两端，用LDMEM培养基冲出骨髓于离心管中，吹打制成细胞悬液. 贴壁培养法纯化MSCs［2］.8 O- w# C, L+ Q$ {7 ^9 H7 I
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抗癌药物工作液浓度为该药的标准血浆峰浓度2倍. 血浆峰浓度（mg/L）=药物用量（mg/kg）60 kg/5000 mL21000 mg/g. 四种药物分别配成20X溶液. 取培养瓶中细胞，调整细胞密度至3107个/L，180 μL/孔接种至96孔板, 预培养24h后，每孔加药物20 μL (终浓度为配制浓度的1/10)，每种药物设3个复孔，每孔总液量为200 μL，继续在培养箱内培养48 h，甩去培养液风干.每孔加冰冷500 g/L三氯醋酸50 μL（终浓度为100 g/L） 固定60 min 后去离子水洗4～5 次，干燥.每孔加4 g/L SRB 100 μL作用30 min, 10 mL/L醋酸轻洗4次,甩干. 每孔加10 mmol Trisbase 200 μL 摇动混匀，在平板振荡器上振荡5 min, 在酶联免疫检测仪测定A值，用空白对照调零，所用波长为490 nm. 将所获HC生长抑制率定义为药物对HC的体外抑制率. 抑瘤率（%）=（无药细胞对照孔A值平均值- 用药孔A值平均值）/无药细胞对照孔A值平均值100%.
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4 c7 v, {: S( l 统计学处理： 采用SPSS 10.0统计软件. 各化疗药物对HC抑制率、MSCs抑制率和HepG2抑制率组组间进行配对t检验，不同化疗药物对HC抑制率, MSCs抑制率, HepG2抑制率分别进行Oneway ANOVA分析.) [: M! D* T. q8 q( ]0 Y; \
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2结果
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对阿霉素、顺铂、洛拉曲克3种药物的敏感性为：HC≈HepG2>MSCs，对丝裂霉素的敏感差异从高到低依次为：MSCs≈HepG2>HC，差异具有统计学意义. 3种化疗药物对HC抑制率、对应MSCs抑制率与HepG2抑制率，之间存在统计学差异（P
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3讨论1 r* `3 }0 a$ q
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肝癌化疗的有效率低下依然是目前临床晚期肝癌的棘手问题，建立一个体外化疗药物敏感实验系统，进行个体化治疗，有望提高肝癌化疗疗效［3］. 现在临床常用的药敏实验主要有MTT比色法、放射性同位素标记物掺入法、三磷酸腺苷生物发光法、区别染色细胞毒法、流式细胞仪测定法等，各有不同的优缺点［4-5］. SRB法药物敏感实验成本相对三磷酸腺苷生物发光法低，相对MTT结果准确并能保存较长时间（15~20 d），是NCI推荐的一种较新筛选抗癌药物的方法. HepG2细胞系细胞本身是永生化细胞，但目前普遍认为：细胞系与现在提出的肿瘤干细胞虽然在增殖性和永生化方面一样，但细胞系缺乏分化能力，与肿瘤干细胞存在某种尚未明了的差异. 我们的实验结果表明，阿霉素和洛拉曲克杀伤细胞作用较强，而MSCs对阿霉素、顺铂、洛拉曲克敏感性明显低于肿瘤细胞和HepG2细胞. 而丝裂霉素对HepG2细胞和MSCs的抑制率却远远高于HC. 这些差异说明HC和干细胞样细胞存在不同的抗药物机制，其抗药物杀伤能力相差较大. 肿瘤干细胞也可能存在相同的耐药机制. 细胞系药物敏感类似于普通HC，相对抑制率都较其他两者高，但在抗丝裂霉素杀伤上却于间充质干细胞相似. 细胞系存在类似干细胞样细胞药物作用位点，可能为区别于普通HC但类似肿瘤干细胞的功能结构，还有待通过进一步的实验研究来清楚阐明.
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发表于 2009-3-3 12:17
发表于 2015-5-22 10:35
