u6启动子的问题

hughliang

回复 runsong 的帖子3 w+ x  o; W1 E, H9 ~, L
0 D. ]2 b7 i. G# u; H4 S
我用这个慢病毒的改型病毒做过shRNA的表达( ^$ k! `  A8 _
% V9 J6 i9 Q$ w& ~+ q: V( i
同这篇帖子一样，也是双酶切后连入，证实有干扰效应。1 \  ]7 I, P6 w. L  ]5 V
7 ~/ I. ^8 G  F, h8 Z
官方Protocol也证实这一点：# E5 F& L. O" Y( G( E+ a5 A; |1 P

% w. `* j. C$ u9 H7 o: L- bhttp://web.mit.edu/jacks-lab/protocols/pll37cloning.htm+ Q2 D. w  B0 @0 E+ T% t

hughliang

; V7 E/ G- T: h7 e( U3 X- b2 A
, N$ Y3 y7 ?' D* E3 {在这里遇见很多做慢病毒表达shRNA的朋友，向大家请教一个问题：
8 J' o0 n" @  E$ ^& V
- j  V9 u2 C/ x& |) b4 X4 ?& ^表达shRNA的慢病毒转染细胞系细胞，流式分选带荧光的转染细胞，培养，western blot证实了干扰效应。
4 O% x+ N9 w' D* C$ V! [3 R. M$ n- o- r
可是，培养数月后western发现干扰效应不再明显，甚至消失。在几株细胞系中都发现了类似情况。
' G' S% _3 H2 {* ^  J& g% w; Z$ P. L, _& P
向大家请教原因和克服的办法，先谢！
+ r/ O" ]  ^$ k* [( w8 ?

hughliang

fguw 发表于 2011-8-16 02:24 3 q" ^. m  t) J* R- A3 `1 c5 k# a
回复 hughliang 的帖子
0 A4 \* V( u: V  V4 |- N
8 W- y9 W% D9 l. m) i8 k可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，

/ I( n2 F' S9 O0 F是有这个可能。, C4 |" }9 w- v+ K! ^, C- K
1 a2 w0 j4 M  {: t' M) ]  e
但流式证实转染细胞仍有荧光，我在想是否细胞能补偿干扰的作用。

hughliang

runsong 发表于 2011-8-16 12:23
& ^, u3 m) t; s& [回复 hughliang 的帖子
) i* Y1 c- x/ a, I) A6 M* |
0 }* B5 a! q4 A9 r( m0 S十分感谢，你提供的线索太有价值了。

9 X5 j  c4 V3 x( d2 E: ^  V不客气5 E0 r4 N% v* J1 ^3 J

: }3 G) c+ Q2 p1 e! Q0 ?! z% A& B也分享两篇供参考
/ D6 ?( S, ~0 j& b% V( u: z: J) `, ~8 f: h; ^; g8 b
祝实验顺利
$ \! ?  j/ V" O+ ]8 j' f
' u6 F$ t* u7 k5 ~

hughliang

回复 fguw 的帖子! [& K* _6 `, _$ T8 ^6 G9 u; E, k
/ W1 c7 ?. X* C4 h' a7 u
是的，偷懒没挑单克隆。
' M3 M1 H0 a6 c( O9 E2 r5 H
7 B2 r2 P0 ~' z8 v$ U我一般流式分选或G418筛选，但没挑单克隆。+ c6 ]6 t( K) S: `  N+ `

% h: z+ I, q# m, Z! @/ n+ D流式检测时带荧光细胞比例最低时约70%多，可能对干扰效应有影响。
6 r' d+ T; o5 T$ Z, @% n# o
4 ^" Q3 L' `6 e$ `* O谢谢！