u6启动子的问题

hughliang

回复 runsong 的帖子5 F1 ?2 n' j5 b; `7 z$ R5 _" O
) d- S1 Z, b2 G; {% J0 {/ \) c: W5 Z9 \
我用这个慢病毒的改型病毒做过shRNA的表达
6 @' g& {* \0 D- v5 ^9 r1 K8 V
" R1 w7 m3 S( j8 `! M- A% T$ r同这篇帖子一样，也是双酶切后连入，证实有干扰效应。
/ O, j5 I! E+ t7 J
6 S& y8 ?$ [/ z: _1 z% I( `2 x官方Protocol也证实这一点：+ O4 f+ s. A( t. |) M2 w) k0 M% L

& A, c* u6 ?# ^9 d) zhttp://web.mit.edu/jacks-lab/protocols/pll37cloning.htm
/ Y6 S7 j) `' V' {

hughliang

* M1 r& I3 m% _+ g) U# `

4 ^9 {7 {- m$ u9 c& p; P1 Z在这里遇见很多做慢病毒表达shRNA的朋友，向大家请教一个问题：
! |/ B5 ]( m; u. A% C& Z" s
8 t9 K8 S  `& {/ Y$ F7 o. o( ~1 t表达shRNA的慢病毒转染细胞系细胞，流式分选带荧光的转染细胞，培养，western blot证实了干扰效应。- ]4 c( g% U( p# _
- V- ~) G- w7 [' N& C! o( G) b
可是，培养数月后western发现干扰效应不再明显，甚至消失。在几株细胞系中都发现了类似情况。
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8 k) t1 N1 ^8 O6 u' I3 i& w向大家请教原因和克服的办法，先谢！% Q1 M# V; I( _& m( n9 x

hughliang

fguw 发表于 2011-8-16 02:24 / e8 I: C& _6 D4 P0 z  ^& X+ a
回复 hughliang 的帖子4 |+ q3 {9 m; z* ?) ?
2 l# c) g: `  t! `# B+ j  ?- Z2 }
可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，

3 w3 n7 v. L9 i: U; P9 L" |
是有这个可能。4 u, R( A3 P! J. \. |( r) c; ]9 U

/ g( |" P8 T8 U$ h% |- }0 o但流式证实转染细胞仍有荧光，我在想是否细胞能补偿干扰的作用。

hughliang

runsong 发表于 2011-8-16 12:23
; Q5 I+ u- F" K6 W3 N( m9 @7 i回复 hughliang 的帖子9 u0 u  T6 @: q3 {0 \/ _0 v6 e

$ S4 Z$ h: x/ N4 z, Z  v! G8 g十分感谢，你提供的线索太有价值了。

! x/ U8 G+ `" w7 n# f2 R不客气
7 t4 E( i" U: Z; ^8 G/ O$ }( s. R- ?
( S& m& P4 o+ m' K也分享两篇供参考2 e  w" g& U$ U
, I9 b: K( ^  g5 [
祝实验顺利
6 p) h4 t3 i! E' E3 J- e; B, C& e: ?% @0 m; g7 a: I

hughliang

回复 fguw 的帖子2 V4 M( G  y) [! C

1 }% ]( d! Z% k; R$ L3 J/ {是的，偷懒没挑单克隆。$ W. I/ |+ O4 o; v( [, J

- \3 z. I1 b6 o8 z" V8 y& v我一般流式分选或G418筛选，但没挑单克隆。
6 e+ S; O' t; u' \! h- J. U- V/ V6 G4 A# r  {2 B: y' i" l
流式检测时带荧光细胞比例最低时约70%多，可能对干扰效应有影响。* W* S; m- _. ?' k5 Q% ~8 x( j$ |. c
7 H  x5 p2 r1 L8 q$ e" H( y
谢谢！