u6启动子的问题

hndxws

最近做shRNA，用的是pBSU6质粒，接入shRNA时，采用的酶切位点是ApaI-gggcc/c。但在具体操作时，有的是用ApaI切过后，要把该位点变为顿末端，就是把ggcc去掉了，然后再连上shRNA，还有的是合成时直接合成了个粘末端的shRNA，直接连上去，这样两者的差别就是ApaI上的5个碱基ggccc。. f1 D$ x9 C" [0 h, Y( _2 M3 g
有人说，U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G，这样好像第二种做法有点问题，不知到底是怎么样的？做过的同仁请给点意见，或提供点具体的操作资料。Thanks！

ambassador

. M( c7 Y3 c, I
7 ^' h  L$ Z- W4 A" l7 t1 l你的这个问题具体怎么解决我不太清楚，不过你上面的“有人说，U6启动时有固定的转录起始位点”，这个不要亲信他人说法，看看这个文献，对你一定有帮助：
+ c& C! N: m- {5 E4 N
6 w8 \! K# T% ^$ nSURVEY AND SUMMARY Transcription by RNA polymerases I and III
. D) p0 U" V: m7 M2 s! C  T9 E* lhttp://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/28/6/12835 `4 D5 p7 A! F$ _" ?$ i

. e7 h9 o% d8 R
" {" k4 K0 t! d1 n" H& R希望解决问题后能分享给坛子上的宝宝。

hndxws

因为大体上大家都知道怎么回事，就是具体的实验操作设计细节很难找到。我参考一下，看看能不能找到具体的东西，找到了的话就再发到这里。请用pBSU6做过这个的同仁也来讨论一下,给点提示。

hndxws

做shRNA的paper很多，但是用pBS/U6的不是很多，就我目前查到的具体操作还是这两种。具体操作是：
4 v. Q7 {6 k" d" P9 j. p! v& T第一种，依次用ApaI、T4 polymerase（或Klenow酶），EcoRI（或其他酶）切割pBS/U6，ApaI是必须要选用的，最后一个酶可以随意选。合成的shRNA的5‘端应该设计成平端的，3’端是黏端的。
  W0 O( D- }/ N8 E# R第二种，直接用ApaI和EcoRI（可选其他的）双酶切，这样合成shRNA时，两端都应该设计成黏端的。! \% ]( Z: Z; f, L+ M
这两个操作的paper我都有看到，而且第一种方法的paper稍多点。但是两个方案哪个更好，没有具体的证据。我这次做这个时，开始没有注意到这个细节，设计的时候，按照的是第二个方案做的，因为第二个方案简单。如果在不知道U6promoter是否是精确起始转录时，先想到的肯定是第二种方案。
9 k" Z! Q" p6 h& c9 Y- n等过一段时间，我做个转染，收个样看看是否第二种方案效率会受影响，就说明第一种方案是不是多此一举或者是必须要按第一种方案做。一切结论都是需要证据的。

hndxws

最近做了两次实验。用病毒介导shRNA转染细胞试了一下干扰效率，发现干扰效率还是很可以的，所以我觉得第二种方案对实验是没什么影响的，也就是说，可以直接用ApaI和EcoRI（可选其他的）双酶切接入shRNA。
. ~. Q4 {/ s' X3 D, H1 j所以就我看来，有的地方说“U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G”。这个说法应该质疑一下。5 {# \( x9 c+ }! }9 _( Y) _
至于第一种做法和第二种方案哪个好，我没对比过，至少第二个方案是没问题的。

runsong

你好，我想用pll3.7做shRNA，也是卡在如何确定U6启动子转录起点的问题上，不知到底需不需要在意这个问题，请赐教。

hughliang

回复 runsong 的帖子0 a3 w9 w, K* m" u, F- d, Q
( d& ?: V2 c/ ~  Q9 j  b  ^7 Z7 O
我用这个慢病毒的改型病毒做过shRNA的表达7 ^0 t+ c$ X6 d

) D# P3 [" p8 }1 Z% V+ c9 S同这篇帖子一样，也是双酶切后连入，证实有干扰效应。2 c  {3 E. @" i0 J2 R8 j
; Y5 q2 i& p- W+ E
官方Protocol也证实这一点：
0 _& Z- y5 b( ~' Q0 f& }, p* e3 s
http://web.mit.edu/jacks-lab/protocols/pll37cloning.htm
. x: Z& P% \7 G( Z# Z  h! t* v4 U

hughliang

2 h5 s  `9 P1 S# N
; @5 S" d$ F9 u# b& t" E  w3 r0 a) m在这里遇见很多做慢病毒表达shRNA的朋友，向大家请教一个问题：
  Z$ }. Y6 n/ w: Y5 d; Z9 Z% N$ f
8 a  B8 V5 I. q5 O" u; n表达shRNA的慢病毒转染细胞系细胞，流式分选带荧光的转染细胞，培养，western blot证实了干扰效应。1 K" O- T+ U, l5 G: S
5 M% ^" P" e! L* M+ w
可是，培养数月后western发现干扰效应不再明显，甚至消失。在几株细胞系中都发现了类似情况。
7 R- j1 }' Y, m  c1 h6 U6 A" p5 d$ w. n/ H( z  ~/ J5 S% S: N
向大家请教原因和克服的办法，先谢！) s% `" z' N" C% l3 }* Z

fguw

回复 hughliang 的帖子  |: I. G* i; X0 I' S+ P& i

& q4 z. v% U% A& v6 M, k, ?可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，5 b' f) a; N  O) v) u
没有实验结果验证，猜的6 S. |" ]8 C' n. z& W( V$ K
作普通转基因有类似问题，
$ F" N5 \5 H6 [, Z/ H0 q" k) _! |有问题，欢迎探讨

runsong

* K5 j" D2 {0 P4 {' `/ M
+ y( T& S- F: y. I# T/ L回复 hughliang 的帖子
. Z0 C7 i$ P7 C7 O0 a) X1 v7 x! U
; F( }4 C7 o9 c% [0 y5 z* W十分感谢，你提供的线索太有价值了。- W( a$ s0 D. m4 }& h4 U5 U5 D
即pll3.7中
: \7 t9 u- o, X1 p3 D- s% oAn HpaI site leaves a blunt end prior to the –1 position in the promoter. The oligo design must incorporate a 5’ T in order to reconstitute the –1 nucleotide of U6.7 `' T$ B0 O$ R8 f* }' m
引物设计应为 Sense oligo: 5’T-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(81NC)-TTTTTTC' C5 B; ]8 ^8 |0 f* Q
而且这个方法与一篇中文文章的做法一样。. S! p7 W9 S. B: W5 h  l
《Cdx2基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定》（钱倩）