u6启动子的问题

hndxws

最近做shRNA，用的是pBSU6质粒，接入shRNA时，采用的酶切位点是ApaI-gggcc/c。但在具体操作时，有的是用ApaI切过后，要把该位点变为顿末端，就是把ggcc去掉了，然后再连上shRNA，还有的是合成时直接合成了个粘末端的shRNA，直接连上去，这样两者的差别就是ApaI上的5个碱基ggccc。
3 B1 K* g( U/ @( F! K- ^; t有人说，U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G，这样好像第二种做法有点问题，不知到底是怎么样的？做过的同仁请给点意见，或提供点具体的操作资料。Thanks！

ambassador

0 ?. p0 X+ n( o8 R0 d; {6 K- r  X& t: H$ c5 c+ h6 S- p
你的这个问题具体怎么解决我不太清楚，不过你上面的“有人说，U6启动时有固定的转录起始位点”，这个不要亲信他人说法，看看这个文献，对你一定有帮助：
  T0 }1 M  u  b  J+ @. ^) I+ C1 k  r" }: k( P; O4 V
SURVEY AND SUMMARY Transcription by RNA polymerases I and III
2 ?1 x' p- t- zhttp://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/28/6/1283
  b# Z' u& R7 c, O; |/ q/ y
% m$ I/ U7 h# ~% Z/ w) Z: {- L1 a7 Z" x; v9 i- r3 r* ^
希望解决问题后能分享给坛子上的宝宝。

hndxws

因为大体上大家都知道怎么回事，就是具体的实验操作设计细节很难找到。我参考一下，看看能不能找到具体的东西，找到了的话就再发到这里。请用pBSU6做过这个的同仁也来讨论一下,给点提示。

hndxws

做shRNA的paper很多，但是用pBS/U6的不是很多，就我目前查到的具体操作还是这两种。具体操作是：
2 x0 D4 G; T- J0 J第一种，依次用ApaI、T4 polymerase（或Klenow酶），EcoRI（或其他酶）切割pBS/U6，ApaI是必须要选用的，最后一个酶可以随意选。合成的shRNA的5‘端应该设计成平端的，3’端是黏端的。3 R/ e! m. \( Y/ C# W$ {: H% |
第二种，直接用ApaI和EcoRI（可选其他的）双酶切，这样合成shRNA时，两端都应该设计成黏端的。
: |( a; r: u; Y$ d) |% U这两个操作的paper我都有看到，而且第一种方法的paper稍多点。但是两个方案哪个更好，没有具体的证据。我这次做这个时，开始没有注意到这个细节，设计的时候，按照的是第二个方案做的，因为第二个方案简单。如果在不知道U6promoter是否是精确起始转录时，先想到的肯定是第二种方案。
1 z; H' d5 v1 r' O* o, |等过一段时间，我做个转染，收个样看看是否第二种方案效率会受影响，就说明第一种方案是不是多此一举或者是必须要按第一种方案做。一切结论都是需要证据的。

hndxws

最近做了两次实验。用病毒介导shRNA转染细胞试了一下干扰效率，发现干扰效率还是很可以的，所以我觉得第二种方案对实验是没什么影响的，也就是说，可以直接用ApaI和EcoRI（可选其他的）双酶切接入shRNA。8 E. \4 v( ~! S- e
所以就我看来，有的地方说“U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G”。这个说法应该质疑一下。, l7 g! m" S' S, a& N3 A
至于第一种做法和第二种方案哪个好，我没对比过，至少第二个方案是没问题的。

runsong

你好，我想用pll3.7做shRNA，也是卡在如何确定U6启动子转录起点的问题上，不知到底需不需要在意这个问题，请赐教。

hughliang

回复 runsong 的帖子
) h; e& y9 h: g; E& p3 y. `, A( Y3 w" c2 M# K
我用这个慢病毒的改型病毒做过shRNA的表达
2 R, j9 [, Q' M: S. ?8 _" P
1 {; O* g4 f0 c% H同这篇帖子一样，也是双酶切后连入，证实有干扰效应。
: J$ U/ `3 W8 p4 e; r0 l5 s! P  {
官方Protocol也证实这一点：6 X2 K  j  p0 b& H5 d( j" I

$ h' ]3 ~; ~! q8 Mhttp://web.mit.edu/jacks-lab/protocols/pll37cloning.htm
+ b9 Q* E! @5 [( g4 M: \. ^

hughliang

5 W7 a* \- _0 w$ R2 H0 k( B
' e, i6 N! W, {: B" t  {5 m在这里遇见很多做慢病毒表达shRNA的朋友，向大家请教一个问题：
1 R) E& g. H/ \  i' |# A* R
4 G4 u6 E+ k3 e' G7 c1 [3 h表达shRNA的慢病毒转染细胞系细胞，流式分选带荧光的转染细胞，培养，western blot证实了干扰效应。
, }* y+ I* X1 ?2 `8 R3 C& M8 a5 u+ d5 i4 X. g+ J* Y
可是，培养数月后western发现干扰效应不再明显，甚至消失。在几株细胞系中都发现了类似情况。: W6 }% _" P! r; F. b8 u
' f  }) b  I* f4 U# {
向大家请教原因和克服的办法，先谢！6 z+ Z& `3 Q% ~+ i

fguw

回复 hughliang 的帖子: ^/ G* m! ^, n: u

: M( a- l4 o6 n8 f可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，4 @! O' P1 X4 h
没有实验结果验证，猜的
& K( v3 k# }1 W- w作普通转基因有类似问题，& C- Z! d" C6 l! j
有问题，欢迎探讨

runsong

0 b7 x+ C/ @' `4 A) e
# y% u) J* N! s1 z2 V  y
回复 hughliang 的帖子4 k6 Y. e# h5 K
3 A; P3 j0 w& `, A5 K& l
十分感谢，你提供的线索太有价值了。) F1 W& t6 \4 r8 V1 \* a6 j
即pll3.7中
5 k* c; o! @! `) c0 PAn HpaI site leaves a blunt end prior to the –1 position in the promoter. The oligo design must incorporate a 5’ T in order to reconstitute the –1 nucleotide of U6.
( q% Q" _3 `' t" [! y引物设计应为 Sense oligo: 5’T-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(81NC)-TTTTTTC
' i) j. _% O* f0 z4 B. U, q2 X. z而且这个方法与一篇中文文章的做法一样。
; l$ @$ B4 i- M, x: I《Cdx2基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定》（钱倩）