u6启动子的问题

hughliang

fguw 发表于 2011-8-16 02:24   u+ T  `" E( l, F" k
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+ Y; T; }, r' ?6 ]2 V# A
7 m- y% }& B' _. z9 t3 Q3 I# d可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，

3 |) v. G: N5 K  ~/ P是有这个可能。
+ c4 j! L5 p, S2 C% ]' ^7 t9 x/ N7 U& g1 q- }3 p# |2 y4 o
但流式证实转染细胞仍有荧光，我在想是否细胞能补偿干扰的作用。

hughliang

runsong 发表于 2011-8-16 12:23 8 U4 ~% O& n7 S$ a0 T3 x
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1 o! q; w2 j' g1 i& b' v) b
$ u- g* W7 e' Q5 R7 }3 z2 s十分感谢，你提供的线索太有价值了。

; k; ?& ]4 w; m: b! ~2 y/ `$ j
不客气, X; _& }. w  ~7 }* D
) M& o4 W$ b& J' M2 ?6 f+ c% j
也分享两篇供参考
" `) x1 q) R. N" a9 i9 f7 a  V# v+ N2 t
祝实验顺利
, R* g! K4 ?& g
6 R! d: U, Y; G

fguw

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- E  Z- z3 {& ]+ B) f* b我觉得你做试验的细胞是多克隆？没有挑单克隆？) t3 ]( b) f8 u7 g) \4 s3 y
流式证实转染细胞仍有荧光，大概阳性细胞比例多少？; S- J/ Q6 i* q0 I
如果比例比较低，可能WB检测时更多的是非阳性细胞细胞（失活）信号。所以KD效果不好。
/ [3 L; G3 S% V% \还有，SHRNA 和GFP使用不同的PROMTOERS，可能在不同的LOCUS活性不一样，当然，我不太认同该观点。

hughliang

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3 V% ~3 u# G0 @
6 m% y' K5 i! e是的，偷懒没挑单克隆。
% T2 \" y5 p! I4 B, U/ K1 v" l- k- V3 o$ h
我一般流式分选或G418筛选，但没挑单克隆。+ [0 E, p/ l, l( k. M

3 ~) t7 R: P( s% r! u2 d. J流式检测时带荧光细胞比例最低时约70%多，可能对干扰效应有影响。
  i+ M& _  f& s/ v, P
# b% K: f4 K6 `9 u+ |/ `! V谢谢！

sarah19860420

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9 L2 d& |  h$ p( @% Y" c- q8 F' E) I$ ^8 s3 X) `
您好，我现在也是想用PLL3.7做shRNA。然后之前看帖子有的人说要形成这样的一个结构forward oligo：酶切位点+G+siRNA+loop+reverse compliment sequence+TTTTT
0 V: o1 v$ r. }2 D# Yreverse oligo：酶切位点+AAAAA+reverse sequence+loop+compliment sequence +C
5 P' J4 @0 X4 B) {8 e
' \1 d5 j, F% W6 u/ O我想问的就是这个G点就是你们所说的U6转录起点的问题吧。那如果siRNA这个核心结构的开头就是以G开头的，还需要加G吗，你们的转录起点问题怎么解决的。我的载体是PLL3.7，酶切位点是Xho I，NOT I。能不能给我点建议。实验室没人弄过。所以想得到一个确定的答案。

w20043459

膜拜各位大神