u6启动子的问题

hughliang

fguw 发表于 2011-8-16 02:24
5 c4 o7 U1 X$ L3 `5 a- w5 `. M7 W回复 hughliang 的帖子
7 i- U5 U$ `; n4 Z- I: F+ u- J
( V  q8 I  [5 _" H1 Z可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，

3 e( L, _: N7 G3 H, ]
是有这个可能。
8 G+ k# Q6 Z. l0 @  Z7 o
8 e3 B. ], g& I7 k) v但流式证实转染细胞仍有荧光，我在想是否细胞能补偿干扰的作用。

hughliang

runsong 发表于 2011-8-16 12:23
0 O: K* f, h4 b, g% B; q0 s7 _6 C回复 hughliang 的帖子
+ O+ c) u3 L  b, @. \' M1 K- y# [) O' i" d4 N
十分感谢，你提供的线索太有价值了。

% j; t& D& q! }/ ]+ a5 `- Z7 X0 E7 g不客气
7 ]% S4 W1 \6 c0 S( e/ @- c2 D+ ?
& v9 G# ]0 r$ n7 O) a也分享两篇供参考4 h( P3 ~: S/ I. ^

3 u: K! b2 }0 I$ ^' j祝实验顺利# g4 Z2 R% V1 t+ l

, N1 r! p, S  I  K! N

fguw

回复 hughliang 的帖子
4 @- x5 X% x9 {# |  g5 D3 x8 R% r1 d* H) Z
我觉得你做试验的细胞是多克隆？没有挑单克隆？
+ i2 \" Y! T# B流式证实转染细胞仍有荧光，大概阳性细胞比例多少？
3 X5 |6 ?$ X' ?" q如果比例比较低，可能WB检测时更多的是非阳性细胞细胞（失活）信号。所以KD效果不好。" p7 a" a. Y2 F6 {
还有，SHRNA 和GFP使用不同的PROMTOERS，可能在不同的LOCUS活性不一样，当然，我不太认同该观点。

hughliang

回复 fguw 的帖子6 p) a$ i) C, o0 {4 S# L

( s+ s0 v8 q" `是的，偷懒没挑单克隆。
+ w$ Z- p) U9 @: ~) v, H. n% u$ {+ g
我一般流式分选或G418筛选，但没挑单克隆。+ l/ S+ J( w' ?0 O

( b  \$ V0 `9 O! B% O& t$ y流式检测时带荧光细胞比例最低时约70%多，可能对干扰效应有影响。( `( [) z5 x# L" R. R( g! B

& z' E3 w! K+ B  {谢谢！

sarah19860420

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$ N$ r2 R* _% X0 [- o7 w/ J# T) p* _+ A% Z# w0 O' v7 R3 _) l
您好，我现在也是想用PLL3.7做shRNA。然后之前看帖子有的人说要形成这样的一个结构forward oligo：酶切位点+G+siRNA+loop+reverse compliment sequence+TTTTT
; C/ u1 `# }4 a( vreverse oligo：酶切位点+AAAAA+reverse sequence+loop+compliment sequence +C
& j( d4 X0 ^: N/ L+ D8 ]0 X
, ^/ g4 y. v+ h' p' N我想问的就是这个G点就是你们所说的U6转录起点的问题吧。那如果siRNA这个核心结构的开头就是以G开头的，还需要加G吗，你们的转录起点问题怎么解决的。我的载体是PLL3.7，酶切位点是Xho I，NOT I。能不能给我点建议。实验室没人弄过。所以想得到一个确定的答案。

w20043459

膜拜各位大神