u6启动子的问题

hughliang

fguw 发表于 2011-8-16 02:24
( w4 D8 q% T& Z  `5 ]6 b; B8 k/ C回复 hughliang 的帖子7 w4 n' d6 x; }1 P! I) e

" \/ ]' W& F. j( ]1 ^可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，

' R2 _# V- O- f# a是有这个可能。1 {3 R( m0 R, W- T6 c4 A
( v* ]2 _+ a8 Z+ r: T" B% ^/ v) y
但流式证实转染细胞仍有荧光，我在想是否细胞能补偿干扰的作用。

hughliang

runsong 发表于 2011-8-16 12:23
3 ]! z& J4 |( r# x( Q7 k回复 hughliang 的帖子
" j. N2 V: n" a* G! l9 S; x; |8 ]8 }! a$ m+ y
十分感谢，你提供的线索太有价值了。

: r: z0 o( G& w
不客气
& `6 Y. g( Z4 A( z7 q. d% p% U) h8 a" d0 V$ R$ k- {0 y
也分享两篇供参考
. T9 q4 n) X4 @" I3 M' ^9 v2 j' @2 a, B' h5 u: U* J
祝实验顺利1 D' C8 ]. [5 ~5 |2 o# X* K! k
1 t, W: C1 o8 w9 [# P) Z. c

fguw

回复 hughliang 的帖子
. X; g2 h2 |7 T
6 e- K2 g1 V% E$ o. U9 B/ `+ w我觉得你做试验的细胞是多克隆？没有挑单克隆？
8 V# f/ o: c4 b9 ^9 b5 v流式证实转染细胞仍有荧光，大概阳性细胞比例多少？
# @+ V( Z$ `! a6 B; w4 h/ r. `如果比例比较低，可能WB检测时更多的是非阳性细胞细胞（失活）信号。所以KD效果不好。- W2 n/ n, q0 G3 b9 `5 P) R
还有，SHRNA 和GFP使用不同的PROMTOERS，可能在不同的LOCUS活性不一样，当然，我不太认同该观点。

hughliang

回复 fguw 的帖子1 k2 Z1 B# L8 v9 F0 w5 C
9 N* V# J# ]4 V# h
是的，偷懒没挑单克隆。: N% G* w/ ^8 Q
, e6 S) Q% U9 r- a% m
我一般流式分选或G418筛选，但没挑单克隆。' e, {. i  d& N9 Q3 I( I

7 c# Q' H8 f$ {# _2 m流式检测时带荧光细胞比例最低时约70%多，可能对干扰效应有影响。
% S# P% \- U; j2 [7 W3 I
+ H" q0 \2 ?7 H/ Z2 f0 Z谢谢！

sarah19860420

回复 runsong 的帖子
7 f: k( m* R9 q+ {1 }7 S/ z. ~: ]
+ H& E4 [' n# C# }1 c8 |7 a您好，我现在也是想用PLL3.7做shRNA。然后之前看帖子有的人说要形成这样的一个结构forward oligo：酶切位点+G+siRNA+loop+reverse compliment sequence+TTTTT- `- D/ h% a9 U4 C6 b$ K7 k
reverse oligo：酶切位点+AAAAA+reverse sequence+loop+compliment sequence +C+ I5 ?( [( G) t5 }

5 \' w$ X+ d. F我想问的就是这个G点就是你们所说的U6转录起点的问题吧。那如果siRNA这个核心结构的开头就是以G开头的，还需要加G吗，你们的转录起点问题怎么解决的。我的载体是PLL3.7，酶切位点是Xho I，NOT I。能不能给我点建议。实验室没人弄过。所以想得到一个确定的答案。

w20043459

膜拜各位大神