u6启动子的问题

hughliang

fguw 发表于 2011-8-16 02:24 1 j# I" g5 ?8 X2 ]
回复 hughliang 的帖子
" `- [. \/ |  T+ d* J' k9 b" @9 i
# c( H4 U6 P2 ?! E可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，

  B. O; {8 I% e7 Q8 Z0 g' f- D
是有这个可能。' s) Z! M* _* }& m' ]0 u7 D
* ?7 H7 ^5 Y& c$ Z6 i/ A) S' l
但流式证实转染细胞仍有荧光，我在想是否细胞能补偿干扰的作用。

hughliang

runsong 发表于 2011-8-16 12:23
* z! A4 C1 x# R8 N回复 hughliang 的帖子
6 V4 J+ o3 }% i. ^  A0 U; r0 m4 c' K
十分感谢，你提供的线索太有价值了。

+ }5 [) d; t  j$ b4 G  F- m
不客气: o/ J- y  [" G0 R: `/ k
! ^9 k2 ^! ~; K: u" i8 `& u7 S5 @
也分享两篇供参考
6 a' N8 s  `1 j, c$ F
5 s7 V& q- z, D" B7 j' @: w0 U祝实验顺利
; W" D% L+ e: T  M" ~2 L5 c( M. c# q0 L2 b( M

fguw

回复 hughliang 的帖子7 B6 ~/ h( s$ R% [3 o
& ~" S5 X8 S3 D1 h! V- y
我觉得你做试验的细胞是多克隆？没有挑单克隆？
* l: \1 l/ b1 W1 n流式证实转染细胞仍有荧光，大概阳性细胞比例多少？
) ]. e: z% @2 i9 [* W; D( O  \如果比例比较低，可能WB检测时更多的是非阳性细胞细胞（失活）信号。所以KD效果不好。
2 |' V1 a* m9 p% {还有，SHRNA 和GFP使用不同的PROMTOERS，可能在不同的LOCUS活性不一样，当然，我不太认同该观点。

hughliang

回复 fguw 的帖子' q  v% L0 ]+ t- C' J  s
: s$ P" U2 _! h  D4 W
是的，偷懒没挑单克隆。, d: I: O2 Z+ E  @# x
( d9 ?% c& v+ L6 }8 ]) i; p- y) t
我一般流式分选或G418筛选，但没挑单克隆。; d) I' o- r. _  I4 V$ f" e- n: p
: u# U9 B- n; h: l
流式检测时带荧光细胞比例最低时约70%多，可能对干扰效应有影响。) Z  I- q' K+ U- w
' Z8 v7 Z6 j" L' o# |7 O
谢谢！

sarah19860420

回复 runsong 的帖子
) e2 L+ S4 j3 D" i0 c9 H4 x9 I% s7 W! W) a" i
您好，我现在也是想用PLL3.7做shRNA。然后之前看帖子有的人说要形成这样的一个结构forward oligo：酶切位点+G+siRNA+loop+reverse compliment sequence+TTTTT
* {, o7 w* a+ P% a3 A4 J/ dreverse oligo：酶切位点+AAAAA+reverse sequence+loop+compliment sequence +C
; N1 Q- Y  {" a  ^- _7 d
0 F' y/ R) l, _$ ^我想问的就是这个G点就是你们所说的U6转录起点的问题吧。那如果siRNA这个核心结构的开头就是以G开头的，还需要加G吗，你们的转录起点问题怎么解决的。我的载体是PLL3.7，酶切位点是Xho I，NOT I。能不能给我点建议。实验室没人弄过。所以想得到一个确定的答案。

w20043459

膜拜各位大神