u6启动子的问题

hughliang

回复 runsong 的帖子
2 J& `4 U; \/ ^
& s4 o$ s/ d& z" m0 d5 |0 |我用这个慢病毒的改型病毒做过shRNA的表达
9 S  p) ^# Z/ P
0 V% k7 P+ b7 ?同这篇帖子一样，也是双酶切后连入，证实有干扰效应。% j" c& {3 A: v: j

) C  C6 e0 T  ~官方Protocol也证实这一点：
$ u  t% T5 f; J. ~2 L7 U( z$ w( k7 L6 S! @6 M: u
http://web.mit.edu/jacks-lab/protocols/pll37cloning.htm+ D/ I, b$ F4 T5 W4 v

hughliang

. W0 _! {& V9 l8 g/ D" z3 f  Y  T- ~' j  X: F
在这里遇见很多做慢病毒表达shRNA的朋友，向大家请教一个问题：! {( `+ z  V5 W3 E7 h
0 m. w5 F- U" a% ^
表达shRNA的慢病毒转染细胞系细胞，流式分选带荧光的转染细胞，培养，western blot证实了干扰效应。
& J# {* `& s6 c/ B2 x1 |8 Z1 q5 N* l' F9 M9 d
可是，培养数月后western发现干扰效应不再明显，甚至消失。在几株细胞系中都发现了类似情况。
) j2 E4 F: R, @1 C$ l
& I  [! R! c# ]& h2 S! |) n向大家请教原因和克服的办法，先谢！8 f. L, z9 b9 @* c3 L/ E, [

hughliang

fguw 发表于 2011-8-16 02:24
, D  j& Y( e5 R回复 hughliang 的帖子
# I7 S: H: q, b3 q$ C2 J$ K7 u  X  e8 Z
可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，

. ?: P: s3 {+ ]
是有这个可能。/ @2 `% w3 L! y: t5 W$ N1 \

+ s/ l$ O+ c. P% v# K但流式证实转染细胞仍有荧光，我在想是否细胞能补偿干扰的作用。

hughliang

runsong 发表于 2011-8-16 12:23
" c9 b2 B. |5 l" V& a9 Q: q回复 hughliang 的帖子
- ?9 i! ~( A/ l+ w  S, m# U3 d
( F% `9 D% ]+ {) E4 Z! @$ i# G十分感谢，你提供的线索太有价值了。

( y9 y" x. m) B不客气( M! n8 j9 T3 i' T4 L3 f

: @) N8 i7 g  h) ^! i: O也分享两篇供参考) o9 V9 s' Q& o

! o5 Q, p# t7 h, @, e' J" l祝实验顺利
' t. w( u* @$ r$ n7 E% R- D+ k6 ]1 F; ?- k) p0 V

hughliang

回复 fguw 的帖子5 ?! F4 n2 j$ ^
! |0 X7 m6 I9 B& g
是的，偷懒没挑单克隆。
( L& X5 j! w! \9 X% K( ^) p+ u5 S$ t$ {- M8 B1 N7 T5 I1 L" o
我一般流式分选或G418筛选，但没挑单克隆。6 i% m8 r1 U  |4 S) i2 m7 E
- X8 b" ~" _+ [- Z
流式检测时带荧光细胞比例最低时约70%多，可能对干扰效应有影响。6 w& y2 h1 V2 L

  {  m8 @. Z$ C谢谢！