u6启动子的问题

hndxws

最近做shRNA，用的是pBSU6质粒，接入shRNA时，采用的酶切位点是ApaI-gggcc/c。但在具体操作时，有的是用ApaI切过后，要把该位点变为顿末端，就是把ggcc去掉了，然后再连上shRNA，还有的是合成时直接合成了个粘末端的shRNA，直接连上去，这样两者的差别就是ApaI上的5个碱基ggccc。
( X5 o" f% _! b+ N4 b" d有人说，U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G，这样好像第二种做法有点问题，不知到底是怎么样的？做过的同仁请给点意见，或提供点具体的操作资料。Thanks！

w20043459

膜拜各位大神

sarah19860420

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1 t% T" l* X  M, |
# x$ y' \4 W; X您好，我现在也是想用PLL3.7做shRNA。然后之前看帖子有的人说要形成这样的一个结构forward oligo：酶切位点+G+siRNA+loop+reverse compliment sequence+TTTTT8 ?, M  e2 i; I  v% W
reverse oligo：酶切位点+AAAAA+reverse sequence+loop+compliment sequence +C6 A- b( k1 E. L/ I

! j+ W; T" k3 r( ~6 d4 K3 S我想问的就是这个G点就是你们所说的U6转录起点的问题吧。那如果siRNA这个核心结构的开头就是以G开头的，还需要加G吗，你们的转录起点问题怎么解决的。我的载体是PLL3.7，酶切位点是Xho I，NOT I。能不能给我点建议。实验室没人弄过。所以想得到一个确定的答案。

hughliang

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2 B3 ^! h! o( ~6 s4 d5 o; N8 Z% r' y6 |
是的，偷懒没挑单克隆。4 T$ T( E7 U3 r+ x$ X

6 ?; v1 n- v2 t3 s3 V( u我一般流式分选或G418筛选，但没挑单克隆。
+ z+ m% i) b6 T5 Q  w# p! L3 S0 H, a& ]( r8 n, @
流式检测时带荧光细胞比例最低时约70%多，可能对干扰效应有影响。
$ x# J. v! j0 U( Z: }  O
. f' `: U" @! e% z( N谢谢！

fguw

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4 I3 C& _  x4 o6 R7 t9 i. Z
8 H% [. B+ M3 z0 S5 I1 N% d我觉得你做试验的细胞是多克隆？没有挑单克隆？, U) o7 l* {2 |# G
流式证实转染细胞仍有荧光，大概阳性细胞比例多少？9 |9 M" m* ]# K% X) T. ^- J0 v
如果比例比较低，可能WB检测时更多的是非阳性细胞细胞（失活）信号。所以KD效果不好。1 x6 U7 v; z& k, `) i
还有，SHRNA 和GFP使用不同的PROMTOERS，可能在不同的LOCUS活性不一样，当然，我不太认同该观点。

hughliang

runsong 发表于 2011-8-16 12:23 2 r) g! g; H1 o$ H
回复 hughliang 的帖子
7 ^0 E0 v$ V& }' @
  y- ]1 I, _% F  k8 l3 ^: C十分感谢，你提供的线索太有价值了。

: ^$ g3 F& J; v9 U! \6 d4 t不客气
6 |0 U5 I1 Y& q* H7 J5 o0 ]; t2 l3 d
也分享两篇供参考6 b3 e2 x1 n9 [5 X
7 U. Q5 U: d3 t9 \
祝实验顺利
+ E: w) M$ C, R; Q* r0 q* r: b3 B  o. }  f3 p

hughliang

fguw 发表于 2011-8-16 02:24 * J% w6 }  ^9 e: `
回复 hughliang 的帖子6 Q: }5 c9 V, T3 ^4 ?+ b
$ z, F( I) z# w! Q+ J- F2 D
可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，

8 @. j# x& O6 ~: P; |! j4 l1 E
是有这个可能。
" I' b0 W; t/ p2 O$ E- O8 F
) `% }* o( k) q) o' k, W但流式证实转染细胞仍有荧光，我在想是否细胞能补偿干扰的作用。

runsong

3 x8 G3 X. N3 t
/ R. y6 E) j6 f) P2 V, ~
回复 hughliang 的帖子2 Z1 t  e9 Y+ @" U2 a: a

) T/ @& z5 f! P) k十分感谢，你提供的线索太有价值了。
9 g4 v6 ^6 e" P8 j) o即pll3.7中( C8 D6 L" a  r0 h4 y
An HpaI site leaves a blunt end prior to the –1 position in the promoter. The oligo design must incorporate a 5’ T in order to reconstitute the –1 nucleotide of U6.
# h/ o1 `( [6 ]- i引物设计应为 Sense oligo: 5’T-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(81NC)-TTTTTTC8 z9 s; E! p+ m! e9 c* x& {" N. Z; Q
而且这个方法与一篇中文文章的做法一样。
5 s3 J1 O1 V# \% Q- x& f/ \《Cdx2基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定》（钱倩）

fguw

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) u6 \! X6 P' ^0 \+ {
* @8 W7 U: w8 N+ f: k2 z可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，
/ |3 l4 n$ R+ c5 e7 a没有实验结果验证，猜的
  q$ N& q) y1 j" M. f作普通转基因有类似问题，
" F' G" e1 g/ v3 Q( N1 {4 P有问题，欢迎探讨

hughliang

: s; e+ S% ^) h
3 o  a9 v( a- i# r- U, ^
在这里遇见很多做慢病毒表达shRNA的朋友，向大家请教一个问题：- Y0 N7 u0 r, u* R  y+ s
7 S+ x$ }) _3 d: G- G: v
表达shRNA的慢病毒转染细胞系细胞，流式分选带荧光的转染细胞，培养，western blot证实了干扰效应。
: F6 {" p5 K7 ]% E& v7 i2 x3 V1 l( L% `$ W0 `+ H4 q3 N" W' h/ Q; [
可是，培养数月后western发现干扰效应不再明显，甚至消失。在几株细胞系中都发现了类似情况。
- ^% t( i3 D* T$ k; F& S: y2 @" W  S8 J5 y$ q9 X- `: {& }! d
向大家请教原因和克服的办法，先谢！
+ _4 x* f9 F, f1 M: y