u6启动子的问题

hndxws

最近做shRNA，用的是pBSU6质粒，接入shRNA时，采用的酶切位点是ApaI-gggcc/c。但在具体操作时，有的是用ApaI切过后，要把该位点变为顿末端，就是把ggcc去掉了，然后再连上shRNA，还有的是合成时直接合成了个粘末端的shRNA，直接连上去，这样两者的差别就是ApaI上的5个碱基ggccc。- K; }# p; N3 i1 G' ?
有人说，U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G，这样好像第二种做法有点问题，不知到底是怎么样的？做过的同仁请给点意见，或提供点具体的操作资料。Thanks！

ambassador

8 h7 Z& |4 W& w; O  M
' T. a. ~0 R  z* y( c+ Q
你的这个问题具体怎么解决我不太清楚，不过你上面的“有人说，U6启动时有固定的转录起始位点”，这个不要亲信他人说法，看看这个文献，对你一定有帮助：# x& X- R" t' \6 p3 D$ a7 `
4 K5 @' l) c: X% {% d
SURVEY AND SUMMARY Transcription by RNA polymerases I and III
, X. j. M+ s) Vhttp://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/28/6/1283
5 u' B) A# |) p& {) j7 }3 d7 }* b# h' j2 d  N# G
" W" L5 u4 P# V0 B
希望解决问题后能分享给坛子上的宝宝。

hndxws

因为大体上大家都知道怎么回事，就是具体的实验操作设计细节很难找到。我参考一下，看看能不能找到具体的东西，找到了的话就再发到这里。请用pBSU6做过这个的同仁也来讨论一下,给点提示。

hndxws

做shRNA的paper很多，但是用pBS/U6的不是很多，就我目前查到的具体操作还是这两种。具体操作是：
; {( L+ ^, {( Z' J$ P9 e6 ]第一种，依次用ApaI、T4 polymerase（或Klenow酶），EcoRI（或其他酶）切割pBS/U6，ApaI是必须要选用的，最后一个酶可以随意选。合成的shRNA的5‘端应该设计成平端的，3’端是黏端的。( k6 u; q9 y7 _
第二种，直接用ApaI和EcoRI（可选其他的）双酶切，这样合成shRNA时，两端都应该设计成黏端的。2 E& t" I& y# P$ S' g* W7 d
这两个操作的paper我都有看到，而且第一种方法的paper稍多点。但是两个方案哪个更好，没有具体的证据。我这次做这个时，开始没有注意到这个细节，设计的时候，按照的是第二个方案做的，因为第二个方案简单。如果在不知道U6promoter是否是精确起始转录时，先想到的肯定是第二种方案。
5 H$ J% a, ~7 W$ m; m2 F等过一段时间，我做个转染，收个样看看是否第二种方案效率会受影响，就说明第一种方案是不是多此一举或者是必须要按第一种方案做。一切结论都是需要证据的。

hndxws

最近做了两次实验。用病毒介导shRNA转染细胞试了一下干扰效率，发现干扰效率还是很可以的，所以我觉得第二种方案对实验是没什么影响的，也就是说，可以直接用ApaI和EcoRI（可选其他的）双酶切接入shRNA。
+ S1 o5 Y2 ]  N0 T8 M' g所以就我看来，有的地方说“U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G”。这个说法应该质疑一下。
* Q( v, s/ i. I! d/ c1 G至于第一种做法和第二种方案哪个好，我没对比过，至少第二个方案是没问题的。

runsong

你好，我想用pll3.7做shRNA，也是卡在如何确定U6启动子转录起点的问题上，不知到底需不需要在意这个问题，请赐教。

hughliang

回复 runsong 的帖子/ }* J; f( Q8 ^% N2 B

% b2 ~( ?' s, j: Z我用这个慢病毒的改型病毒做过shRNA的表达
0 i/ i3 x) b, q* \. m. I: A- d/ w4 r$ b" E! `
同这篇帖子一样，也是双酶切后连入，证实有干扰效应。$ w: I3 M0 Z9 s- p/ u

+ q/ W1 ~( `5 Q1 J4 S2 [官方Protocol也证实这一点：! @5 q  p' O+ l$ r# A

* h+ S( N$ F/ rhttp://web.mit.edu/jacks-lab/protocols/pll37cloning.htm
+ [- h! p! T+ o2 s) j' s5 I

hughliang

; u0 K7 K9 r6 R1 _% y3 ^% R9 i* N7 W4 y1 k' D) r
在这里遇见很多做慢病毒表达shRNA的朋友，向大家请教一个问题：) M7 w% T7 x3 a# s/ u
9 G) z( x( ^' g
表达shRNA的慢病毒转染细胞系细胞，流式分选带荧光的转染细胞，培养，western blot证实了干扰效应。
: K- [' Q( y& R; q: t3 Y5 Y3 @' W* L6 ?' P
可是，培养数月后western发现干扰效应不再明显，甚至消失。在几株细胞系中都发现了类似情况。' B+ s' v5 |$ A5 L/ l) ?; y- W- @
0 F5 r+ H! q- o/ n0 j
向大家请教原因和克服的办法，先谢！
2 A& q* @8 k1 Y: |* H) w3 _

fguw

回复 hughliang 的帖子
, d6 K- b. z) S. E: c
9 _& p* q8 P" k可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，
* a1 H4 }0 v0 B  C3 \没有实验结果验证，猜的
' y! f% O; x! }/ U! h, J作普通转基因有类似问题，9 x9 t  T; V! n7 K0 ^0 L4 s
有问题，欢迎探讨

runsong

' x0 U# d$ `  E6 D  S. P5 c
& ~' |- L: y4 Y7 V, s3 n回复 hughliang 的帖子
/ J$ O- B- A1 U' |$ ~! `" ]) z/ {
; S8 c; b/ l( Q1 \1 y" J7 k十分感谢，你提供的线索太有价值了。
5 y. {1 u6 |3 c  G8 x% B即pll3.7中& B8 |: D$ n. |+ ^+ G
An HpaI site leaves a blunt end prior to the –1 position in the promoter. The oligo design must incorporate a 5’ T in order to reconstitute the –1 nucleotide of U6.
1 q# U; C, q7 n引物设计应为 Sense oligo: 5’T-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(81NC)-TTTTTTC
  N$ r4 U9 }/ j而且这个方法与一篇中文文章的做法一样。1 n, K& K8 f. r- m0 ^) F4 d+ ?
《Cdx2基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定》（钱倩）