谈下平末端连接的感受

xujie158

前段时间从一个国外教授那里要到一个质粒，质粒是这位教授实验室自己构建的其中只有一个SmaI位点可以插入外源基因，因为是平末端连接效率超级低，而且还有反向连接的问题；期间尝试过三四种方案，如直接连接、载体去磷酸化、目的片段磷酸化处理、4摄氏度48h连接等方案均未奏效，后来尝试了一下在连接反应体系中加入适量SmaI酶（本人插入片段为基因全长，PCR使用KOD Plus），发现效果还行，总共挑出十几个菌，鉴定发现大部分连接上了外源片段，而且有几个为正向连接，正在测序中，希望对后来人有所帮助。
) I. ?  h. ?; s0 ~* P  S1 y另外，本人已经将该质粒进行了一些改造，在其上又增加了四个酶切位点，且均产生粘性末端，呵呵！

xujie158

回复 2# hdc2001 + r! u& D; ?# I3 n
9 H+ B* a- W  k3 W

/ N( I7 U& i" H( C3 H    因为我的载体使用的是SmaI做的切割，SmaI识别序列为CCCGGG，切割后产生平末端一端为CCC和另一端GGG，而我的基因是ATG起始TAA终止，连接上之后其SmaI切点也就消失了，而自连的情况下，其产生的CCCGGG仍可以被SmaI所切割，这样的一个体系，其平衡更容易产生基因与载体的连接吧！
2 V4 Y0 [/ d  m! m6 g还有昨天的测序报告表明这种连接很有效，测序均为阳性结果。