谈下平末端连接的感受

xujie158

前段时间从一个国外教授那里要到一个质粒，质粒是这位教授实验室自己构建的其中只有一个SmaI位点可以插入外源基因，因为是平末端连接效率超级低，而且还有反向连接的问题；期间尝试过三四种方案，如直接连接、载体去磷酸化、目的片段磷酸化处理、4摄氏度48h连接等方案均未奏效，后来尝试了一下在连接反应体系中加入适量SmaI酶（本人插入片段为基因全长，PCR使用KOD Plus），发现效果还行，总共挑出十几个菌，鉴定发现大部分连接上了外源片段，而且有几个为正向连接，正在测序中，希望对后来人有所帮助。' o& J( g4 ~8 l8 c3 |
另外，本人已经将该质粒进行了一些改造，在其上又增加了四个酶切位点，且均产生粘性末端，呵呵！

hdc2001

连接反应体系中还加Smal起什么作用呢？连接反应体系与酶切反应体系不一样。载体改造增加酶切位点应该可取。

xujie158

回复 2# hdc2001
: ?+ c* L/ l( @$ Z. |
: [2 n# C+ ~" @+ q- ~# [2 `7 B- z9 W( l* u* y
    因为我的载体使用的是SmaI做的切割，SmaI识别序列为CCCGGG，切割后产生平末端一端为CCC和另一端GGG，而我的基因是ATG起始TAA终止，连接上之后其SmaI切点也就消失了，而自连的情况下，其产生的CCCGGG仍可以被SmaI所切割，这样的一个体系，其平衡更容易产生基因与载体的连接吧！. R  z- N6 O* X8 K: p
还有昨天的测序报告表明这种连接很有效，测序均为阳性结果。

军医

方法很好

zhongshanlh

很N很N，我是新手，以后借鉴一下

weiyepan

平端连接请加PEG，37度连接

怕起名

你不会是我师兄吧，哈哈

Pseudomonas

谢谢分享。; C# N/ `, H1 X  J1 [8 S
另一个做法是先用QuikChange修改多克隆位点，加上几个粘末端位点，然后克隆就容易多了！

王乾

DNA平末端连接的效率本来就比较低 注意下面的几个方面# s% P4 f+ _6 Y: _' V# U2 M; s
1.平末端连接时,以载体与片段末端的摩尔比为1：3 作为参考值
8 a7 w) Y8 D. ~4 a8 p# P2.连接时,T4DNA 连接酶的浓度应比粘末端连接时高8～10 倍4 o3 ~1 o* d: a4 {0 E
3.增加连接的时间，有文献说反应条件在4 ℃,12 h 最好
0 ]( {  y5 d- \' h6 f4.加入凝聚剂，30%PEG 8000 1~1.5μl（10微升体系）

christophe

我也做过相当一段时间的平端连接，一点经验是引物加磷或者片段加磷要用新鲜的ATP（ATP易降解，最好配成1M母液放在-80保存，100mM母液放在-20，平时用的10mM就用小PCR管分装，每次用一管）。载体酶切、去磷酸化需要多次回收的过程，最好一次性多处理些，使浓度尽量大一些，这样可以在较小的连接体系内加入更多的PCR片段去连接。同时载体和片段的量要足够，均应达到50-100左右，因为平端连接是一个分子不断碰撞的小概率事件，浓度大一些，概率会高一些。做得好的话，2K左右的片段还是比较容易搞定的。楼主往连接体系里加酶的方法也不错，以后也可以借鉴一下！