谈下平末端连接的感受

深海寂寞鱼

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1 k# H( |9 H8 x: U) f* z* g
6 l" Z1 n" I9 _  H呵呵......果然是高人。学习了。/ |0 g! k7 l1 r7 ^- T& v
5 G" q( k; e/ g; Y; }
另外有几个小问题向你请教一下：
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1. 在这个实验设计中，加入SmaI是最重要的一点，但是T4 DNA连接酶的Buffer和Sma I限制性内切酶的Buffer毕竟是不相同的，你是如何解决Buffer的问题的？$ ^" b* d8 F' ?6 y) y" S
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2. 如果你仅仅是在T4 DNA连接酶的反应体系中加入了Sma I，然后在4度或者16度进行连接反应，那么你如何保证在这样的buffer和温度条件下，Sma I限制性内切酶能发挥出相应的作用？因为通常Sma I在30度的活性较好。
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3. 不知道你是否能够分享一下你的反应体系？上面你提到在反应体系中加入适量Sma I。不知道具体的量大概是多少？
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( P: _4 s. B' Y+ M" P2 Y. s. l* b. }; |& P# d( v
对于你的这个经验，我觉得特别的好，可以在以后的实验中带来很好的思考。! ~( Q+ f# F# t( k* B- L& E9 V
1 d; x+ m# d" A( F. T3 s& s
以上是我的一些小的疑问。希望能得到你的指点。谢谢啦！

hndxws

我觉得楼主可能有点心理上的作用吧。你的方法只会让你在鉴定克隆时变得容易些，并不能提高你连接的效率，平端连接不会因为你的末端是个酶切位点就会提高，我觉得可能是ATG或者TAA在末端时，末端的双链结合没有GGG或CCC稳定，因为他们的氢键个数不一样。不知你开始时鉴定克隆的方法与你后来用了酶切位点后的鉴定方法有什么不同？开始时是使用PCR鉴定或是怎么鉴定的？

王乾

你干嘛用Smal切载体呢？用Xmal切产生粘性末端，连接效率要高很多的，不信你试试。

osterix

现在还有新的酶切连接方法，只要酶切两端有互补序列即可，你可以搜索一下呵呵。