间充质干细胞临床试验中的问题及其解决策略 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:19 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：张薇薇，  郭子宽作者单位：辽宁省人民医院心血管内科，沈阳 110016
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      【摘要】  人间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）具有多向分化特性、免疫调节作用及体外分离培养扩增操作简便，因此国内外多家单位均开展了MSC临床试验，以预防和治疗异基因骨髓移植后移植物抗宿主病，修复骨和软骨损伤，治疗心肌梗塞和肝脏损伤等多种疾病。然而，越来越多的资料提示，在制订临床应用方案及具体实施过程中，必须考虑到细胞培养用动物血清蛋白的内在化、植入细胞体内存活以及分化专一性等诸多因素。本文综述了临床试验设计中宜注意的问题。 " ^% W& l6 e% U; w2 t6 s
      【关键词】间充质干细胞
   ProblematicIssues in Clinical Trials of Mesenchymal Stem Cells andUnraveling Strategies——Review
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ZHANG WeiWei，GUO ZiKuan1

Department of Cardiology, People Hospital of Liaoning Province, Shenyang 110016, Chain; 1Department of Experimental Hematology, Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850, China/ p- w# c# `3 m+ b$ I
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AbstractWith the capacities of multiple differentiation, immunoregulatory activities and easy handling for isolation and culture expansion, human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) have been utilized in clinical trials for the prevention and treatment of graftversushost disease in allogeneic bone marrow transplantation, repair of bone and cartilage defects andtreatmentof cardiac infarction and liver injury. However, increasingly experimental dataindicate that a great deal ofissues, such as intraneutralization of calf serum proteins into cultured MSCs, survival of engrafted cells and subsequent cell differentiation tendency, should be in stringent consideration before clinical trials are designed. In this paper,these issues that should be raised and solved in clinical trials with MSCswere reviewed .

Key wordsmesenchymal stem cell; clinical trial
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J Exp Hematol 2007; 15(4):901-904

间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一群存在于骨髓、脂肪、骨实质、胎盘及骨骼肌等多种组织中的干细胞，具有向骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化功能［1］。此外，在适当的诱导下，MSC可分化为肌肉细胞和神经元样细胞［2］。也有报告自称， MSC分化能力接近于胚胎干细胞，可以分化为上皮细胞、内皮细胞和肝脏细胞［3-5］。研究已经证实，MSC支持体外造血并促进造血细胞体外扩增［6］；同时，在体外MSC本身不引起异体T细胞活化，且抑制由非特异性丝裂原或异体淋巴细胞激活的T淋巴细胞增殖［7，8］。通过密度梯度离心分离低比重细胞（比重＜1.73 g/ml），利用MSC的贴壁生长特性，从人骨髓中分离MSC的技术已经成熟［9］。细胞在体外增殖旺盛，一般而言，获取5 ml骨髓分离细胞，体外培养4-6周后可获得108以上MSC。因此，MSC在造血细胞移植、器官移植、骨和软骨组织修复、心肌梗死和肝脏损伤中具有潜在的应用价值，某些治疗措施已经进入临床试用阶段。目前，美国国家食品药品管理局（Food andDrugAdministration, FDA）已经批准MSC输注进入II期临床试验，以期减轻异基因骨髓移植中的移植物抗宿主反应（graft versus host reaction, GVHR）。此外，FDA批准的有关MSC细胞治疗的临床方案包括：①MSC静脉输注治疗Crohn病；②MSC局部应用治疗牙周疾病；③MSC静脉输注治疗心肌梗死；④MSC修复半月板及⑤GCSF动员的骨髓MSC治疗心肌梗塞等。国内的临床研究中适应证的选择更为广泛，利用自体或异体MSC预防或治疗GVHD、心肌梗死、骨或软骨缺损、糖尿病足坏疽、肝脏损伤或股骨头坏死等，多家单位的研究已经进入临床试用阶段。但是，必须指出的是，有些临床试验尚需要充分的理论支持，有关MSC体外培养体系的标准化以及体内存活及分化趋向等，仍需要通过严谨的实验进一步阐明。本文将提出相关问题，并对相应解决策略进行讨论。# E. l# ]4 Q2 x. H" o. O# ]
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人骨髓中MSC的含量很低，因此临床应用前必需进行细胞的体外扩增。目前国内外移植中心或实验室所报道的人骨髓MSC分离方法，均基于MSC的贴壁特性去除其它细胞，MSC增殖为由纺锤形细胞组成的致密贴壁层。连续传代本身就是细胞纯化的过程，由于MSC的增殖优势，血细胞和内皮细胞随着传代培养而被剔除，同时MSC进入指数扩增阶段，最终细胞扩增达1亿倍以上。但是，由于初始接种细胞成分不同，培养体系组成的差异诸如血清浓度及血清种类差别以及细胞因子的添加与否及添加成分等等，这些均可影响最终细胞产品的纯度和具体功能。事实上，将单个MSC接种于常规培养体系中，使之形成成纤维细胞集落形成单位（colonyforming unitfibroblast，CFUF），集落内细胞形态均一，细胞表达成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞等多种系列特异性的mRNA。因此，体外培养的所谓MSC只是一个形态和表型相对均一、分化潜能和所处发育阶段迥乎差异的细胞群体［10］。8 N( [: p& H3 n# d8 @
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此外，培养中的人骨髓MSC细胞间的体外增殖能力和植入能力也有很大差别。David等［11］发现，形态上体积小而增殖较快的细胞，在体外培养初期有很强的自我更新能力，细胞倍增速度快；而体积大的细胞增殖速度则较慢。Stro1阳性细胞可能更易于植入骨髓、肌肉、脾脏等组织，而阴性细胞易于滞留于肺循环［12］。# r; p, y$ y- ?5 K' @0 o# ~1 y) ]

到目前为止，人们尚未建立一种被多数研究单位广泛接受的统一流程，进行规模化的人骨髓MSC分离纯化及扩增。通过系统的实验设计，观察不同种类血清（包括适用于临床应用的人AB血清或血浆）、血清浓度、细胞因子、细胞生长因子、不同培养液乃至不同产地的培养瓶等可能影响人MSC生长及分化的多种因素对最终所获细胞功能的具体影响，参考“人体细胞与基因治疗规范”，建立适合临床应用的人MSC分离培养标准操作规程。- Z- R/ {9 ^" J7 a1 ^

动物血清蛋白内在化
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必须指出的是，目前广泛应用的人骨髓MSC培养体系多采用胎牛血清，而残存的胎牛血清本身可引起严重的免疫反应。在体外培养过程中，细胞的吞噬作用使牛血清中的蛋白分子细胞内在化，即使通过洗涤也不能清除牛血清蛋白。一般而言，体外培养收获108MSC，其残存的胎牛血清蛋白量在7-30 mg之间，多次输注时存在并发血清病的危险［13］，必然干扰治疗效果及其评估。因此，建立一种无异种血清的人骨髓MSC培养体系，是开展相关细胞治疗必需的基础。
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为此，有人尝试应用血清替代品体系进行人骨髓MSC培养，发现在无血清体系中，细胞能保持其多向分化特性，增殖速度较传统体系下更为旺盛［14］。但是，血清替代品中多含有牛血清白蛋白，它是主要蛋白质成分之一，无血清培养体系虽能保证细胞培养批次及实验室间的稳定性，仍不能从根本上解决异种蛋白内在化问题。采用自体血清或血浆，或许是解决这一问题的根本途径［15］。另外，利用人AB血清或血浆进行细胞培养也往往能达到扩增骨髓MSC的目的。  ]& k- i( |; _9 a8 ^9 L+ k- K: ^1 u
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MSC的植入与存活/ T7 J4 L$ ]* U% E9 J

在骨和软骨组织构建中，MSC是修复骨/软骨缺损理想的种子细胞。实际应用中，常将自体骨髓MSC接种于一定大小和形状可降解生物材料上。这些材料主要成分有多聚乳酸、多聚乳糖酸或羟基磷灰石。之后，将含细胞的生物材料植入机体组织缺损部位。细胞在局部微环境的诱导下能较为特异地向某一组织分化，而生物材料逐渐被机体吸收或自发降解。新生组织经过重塑后，即可形成完整的组织结构，损伤组织的功能得以恢复。, n' m' \1 w2 d3 a7 b2 ]% q3 @

然而，MSC植入后脱离了特殊的培养环境，而通过微循环渗透方式所获营养成分所及的范围在100-200 μm之间。因此，植入细胞大部分因营养缺乏而很快死亡，细胞并不能发挥其增殖分化功能。从已有的动物实验研究资料看，单纯应用MSC复合生物材料，不能很好地修复较大的骨缺损［16］。临床试验长期随访发现，也有部分病例出现骨吸收现象。因此，通过基因修饰或配伍应用生长因子等手段，促进植入细胞的存活和定向分化以及新生组织血管形成，可能是解决MSC作为种子细胞在骨组织修复中生存的有效途径。
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在设计MSC治疗其它疾病如GVHD、心肌梗死等的临床方案时，也要面对细胞植入和存活率问题。目前人们普遍认为，静脉输注的骨髓、外周血动员或体外培养MSC，只有极少数MSC能植入受者体内，多数细胞滞留于微血管处而死亡［17］。体外培养的MSC并不是表型和功能均一的细胞群体，Stro1阳性细胞可能更易于植入骨髓、肌肉、脾脏等组织，而阴性细胞易于滞留于肺循环［12］。因此，提高MSC抵抗低营养的能力，或探索合适的细胞亚群进行输注，可能是提高MSC体内植入效率，从而发挥体外近似的效应。4 I  g. t9 h& n# V

MSC的分化特性与治疗目的的一致性造血重建是确定一群细胞是否含有造血干细胞的重要标准。以此推论，如能通过移植手段达到间充质组织重建，即可认为某一群细胞内含有MSC。然而，成体内MSC含量极低，在骨髓中约为造血干细胞含量的1/10，通过输注动员的外周血或骨髓移植物的方法，不能将足够量的供者源MSC移植给受体。更为重要的是，由于成体间充质组织更新代谢水平较造血组织低，可能更高比例的间充质干细胞处于G0期，不易被常规剂量的放射或化疗药物所清除。因此，组织重建不适合于对MSC的判定。目前，确定MSC的“金标准”都建立在体外实验的基础上，即细胞自我更新能力和多向分化特性，包括形成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的能力［18］。在体外实验中，MSC很难向具有功能（而非表型鉴定）的神经元［19］、肝脏细胞和肌肉细胞［20］分化。因此，通过自体或异体MSC输注，治疗神经损伤、肝脏损伤或心肌梗塞等疾病，似乎缺乏详尽的理论支持。' H+ v% p- R. Q- Q
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但是，局部或静脉输注MSC治疗非中胚层组织损伤，也可能具有一定的效果。其机理可能体现在以下几个方面：①MSC可以分泌大量的促进细胞增殖分化的因子，如肝细胞生长因子、神经细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子等［21］；②MSC与损伤细胞的融合，可部分发挥某一特定细胞的功能；③MSC的免疫抑制效应减轻了因组织坏死引起的局部炎性反应［22］。# e! ]2 F! B  ]

总之，MSC的多向分化特性、免疫调节作用及体外分离培养扩增操作简便性，为其临床应用奠定了基础。然而在具体的临床应用过程中，必须注意细胞培养的标准化、植入细胞的存活以及细胞固有的分化特性等问题；临床试验设计必须有充分的理论支撑。只有如此，方可为MSC相关细胞治疗或组织构建替代治疗，找到合适的临床适应证。: D" E: P, B7 i" y. S* w
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