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作者：吴 敏 ，亢军琪 ，林 洪 ，韩善华 ，胡火珍
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9 X) g+ e a) H) J 【关键词】间充质干细胞7 Z# H, Q* ?$ i3 l. w& G
摘 要目的: 探讨体外分离培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的方法，明确增殖及生长特征。 方法: 从骨髓中提取间充质干细胞，加入淋巴分离液后用密度梯度离心培养法和静止贴壁培养法，分离纯化大鼠骨髓MSCs，对其进行传代扩增和形态学观察，细胞计数，绘制生长曲线。 结果: （1）通过离体培养，可使体内环境下低丰度的骨髓间充质干细胞实现数目扩增;（2）体外单层培养条件下贴壁生长的骨髓间充质干细胞大多数具有成纤维细胞生长特性。 结论: 对比两种分离方法可知淋巴分离法更有利于骨髓间充质干细胞的纯化，体外培养成功为今后进一步利用体内间充质干细胞研究细胞衰老，并建立衰老模型奠定了基础。
6 F7 Y D3 `0 \ 关键词间充质干细胞;骨髓;SD大鼠
8 y8 x' S2 A7 a7 N) b: F 骨髓中存在着多潜能的间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC），易于分离，能在体外大量扩增，并具有较强的可塑性 ［1］ 。除能在体内、外被诱导分化形成骨、软骨、脂肪、神经胶 质等细胞以外，还能分化形成包括血液、皮肤、肝实质细胞、胰腺细胞以及视网膜等不同类型的细胞。由于间充质干细胞跨越了人胚胎干细胞所面临的伦理问题，使得间充质干细胞在细胞治疗及组织工程等应用方面具有其他组织干细胞不可比拟的优势。/ v: {3 v* y3 ^' k3 o7 E
1 材料和方法( \+ ] T3 E9 @* s8 y
1.1 动物SD大鼠（四川大学实验动物中心）。# s6 [# {) ^; J8 k/ ~9 g
1.2 试剂淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），各种常规试剂;培养液:DMEM培养基（GIBICO）;小牛血清（华西哈里生化试剂公司生产）;胎牛血清（GIBICO公司产品）。9 ]( k6 }. I! B* n4 q7 k1 m9 r* p+ M4 K
1.3 试剂配制
. w6 d: ^4 P* z1 G' {7 m( d 1.3.1 含20%血清DMEM培养液配制 成分:碳酸氢钠1.5g;DMEM培养基10.4g，1000ml双蒸水.配制:用磁力搅拌器搅拌至溶解，加入双抗（青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml），调PH至7.0～7.2，过滤灭菌。8 y2 k7 X' X$ _, C3 Z
1.3.2 D-HANK'S的配制 KCl0.4g;KH 2 PO 4 0.06g;NaCl8.0g;NaHCO 3 0.35g;Na 2 HPO 4 ?12H 2 O0.132;D-葡萄糖1.0g;酚红1ML，加入1000mL双蒸水，用磁力搅拌器搅拌至溶解，调PH至8.2，每次使用前都需121℃高温灭菌30分钟。
2 O! }7 @* d+ Z3 S2 S# v+ A 1.3.3 胰酶的配制 成分:胰酶0.04g;EDTA1g;D-HANK'S200ML配制:用磁力搅拌器搅拌至溶解，调PH至7.2左右。 _% w8 L/ ?; O9 ^
1.4 间充质干细胞的分离纯化与培养
: x& S* Y' k( k+ M9 k1 n$ f: D# g" A 1.4.1 标本采集 参照李素文的方法 ［2］ 稍作改进:（1）选健康2月龄大鼠两雄一雌，断颈法杀死后用75%乙醇浸泡杀菌;（2）无菌取股骨和胫骨（必须把肉剔除干净），用骨剪剪断关节处;（3）用一次性5号注射器吸取无血清DMEM冲洗出股骨骨髓腔中细胞;（4）.离心1000转/min，5min，弃上清液，取沉淀;（5）向沉淀中加无血清的DMEM培养液4mL，用吸管轻轻吹打吹散细胞，沿离心管壁轻加淋巴细胞分离液4ML，1900转/min，20min，取中间混浊层（乳白色）;（6）向混浊层加无血清的DMEM混匀后，1000转/min10min;（7）重复第（6）操作三次.最后，添加含20%血清的DMEM培养基约2ML，用巴氏吸管吹打分散细胞，置CO 2 培养箱中进行原代细胞培养并每天观察其生长情况。# u6 k8 [* x U( p
1.4.2 骨髓间充质干细胞原代培养 将骨髓间充质干细胞按照1×10 4 /mL接种于25mL培养瓶，5%CO 2 饱和湿度，37℃培养箱培养每三天换液1次，倒置相差显微镜下动态观察细胞形态和生长情况，培养瓶每天取其中五瓶，每瓶随机取10个视野进行计数，取平均值描记生长曲线。
. R8 y9 c& _4 Z% o' c# M3 X0 w+ y 1.4.3 骨髓间充质干细胞传代培养 大鼠间充质干细胞胞的原代培养细胞铺满单层后，即可用含EDTA的0.25%胰酶将贴壁细胞消化分离（37℃，2～5min）进行传代培养，当细胞长至70%铺满时再传代培养，直至细胞出现衰老现象。9 ~; }1 M1 D) b5 x. ?# L( e) a
2 结果
1 }. {, V& f* F: _5 X3 K" ]5 i" G 2.1 细胞活力测定台盼蓝染色后，蓝染细胞为死亡细胞。按未被染细胞所占细胞总数的百分比即为初步得到细胞活力的数据。刚分离的具活性的MSCs为球形，具折光性，台盼蓝拒染，活细胞率为96.3%。
y5 F( G7 P9 ]5 C& ] 2.2 原代培养骨髓MSCs原代接种培养后2～3天，显微镜下既可见有稀疏分布的单个细胞贴壁生长，细胞为梭状，呈典型的成纤维细胞样外观，（图1）原代培养第3天首次换液后，可见有散在分布的贴壁细胞数目有所增加，细胞形态同前;第6天换液，见原来的单个细胞或细胞集落形成多个细胞克隆（图2）;第12～14天各个细胞克隆扩大直至铺满培养瓶底面（图3）。原代培养生长曲线见图4图1培养的第二天图2培养的第六天图3培养的第八天（图1、2、3间充质干细胞原代细胞各生长时期形态）2 P$ V9 _3 o3 v8 j7 K3 S
2.3 传代培养骨髓MSCs传代细胞的生长较原代要快，大多数于接种第9天即可铺满培养瓶底面;多数样本于第10代出现衰老现象。换成GIBICO公司产的胎牛血清，细胞生长速度加快，可传代30代方出现衰老。在传代过程中发现胎牛血清传代细胞具有以下特征:（1）每次传代培养的生长滞缓期24～36h;（2）每次传代培养的骨髓MSCs对数增殖期为2～4天;（3）对数增殖期结束后，进入平台期而小牛血清培养基各期相对较长。 0 ^4 W# [% d; I4 c* U8 w
3 讨论
6 t6 ^ @6 J( j5 N MSCs在骨髓中的细胞量很少 ［3］ ，因此将体内的骨髓MSCs在离体条件下进行分离纯化并进行体外扩增就显得尤为重要。这不仅有利于深入研究MSCs生物学特征，而且对探讨细胞衰老机制及药物对细胞的影响大有帮助.由于白细胞及骨髓中造血干细胞在体外培养条件下主要呈悬浮生长的特性，故通过体外单层细胞培养及定期更换培养液，即可剔除不贴壁生长的白细胞和造血干细胞，所余的贴壁生长细胞即主要为MSCs。MSCs分离时使用静止分离及淋巴分离液分离这两种方法并进行比较，发现静止分离后的细胞比较杂，纯度不高，虽然经过多次换液，仍然有很多形态不同的细胞，如长梭状，圆形，纤维状等等;但用淋巴分离液可观察到较纯的细胞，并出现细胞分化现象，呈现出大片的有长丝状辐射条的连接细胞，可推测MSCs细胞可能向神经细胞分化，体现细胞多能性。2 D1 a: F0 i& X5 x3 L& w. _
研究发现体外单层细胞培养条件下贴壁生长的组织细胞会失去原有的组织结构与细胞形态，分化减弱或不明显，并出现“返祖现象”（呈成纤维细胞样外观）。推测其原因可能是当细胞离体培养后来自其它细胞的外源性信号被中断，导致受其调控的分化表达减弱或停止，而进化过程中保守的细胞增殖活动却可维持，于是导致了体内、外条件下细胞形态的差异 ［5］ 。由此推断根据干细胞具有分化的潜能，可以探讨干细胞在人为控制下分化成目的物做有关分化研究。6 g/ b8 [+ X, d- K3 w" H3 b
大鼠骨髓MSCs的培养生长曲线显示，MSCs在体外培养条件下生长与其它细胞一样经历了生长停滞期、对数增殖期和生长平稳期。原代培养的细胞群体倍增说明MSCs的增殖分裂能力十分活跃，传代培养的MSCs增殖分裂能力更快，因此通过离体培养，使体内环境下低丰度的骨髓MSCs在体外扩增是可行的。传代培养的结果显示，在经历了10代的传代培养以后骨髓MSCs才出现衰老征象，即细胞生长速度缓慢，多数细胞出现核固缩、核碎裂及由培养瓶底面脱落（培养瓶中出现大量悬浮细 胞）等。这与许多其它种类细胞的体外传代培养的结果基本一致 ［5］ 。此外，与原代培养生长曲线相比，传代细胞的生长潜伏期较短，每代大约8天可铺满培养瓶底面。因此，以3～4代细胞进行各种实验比较合适。4 O9 n# u/ C$ U1 }8 `+ {
另外，所有原代及传代培养的结果表明，体外培养条件下骨髓MSCs具有许多成纤维细胞的生长特性。骨髓间充质干细胞能够通过分化形成多种中胚层组织、包括骨组织、肌腱、肌肉、脂肪组织以及维系造血干细胞分化的骨髓基质结缔组织 ［1］ ，因此，在后续实验中可以使用MSCs进行分化研究，作为生长过程明显的研究对象，可以此大鼠间充质干细胞构建衰老模型，进行抗衰老药物研究。) V( a7 ]3 _: Q
参考文献 V, o/ K+ D @+ V" z
1 Caplan AI，Mesenchymal，stem cells.J Ortthop Res，1991;9（5）∶641.% a7 w' r% b- T
2 李素文.细胞生物学实验指导.高等教育出版社和施普林格出版社，2001∶10
, r# L0 w1 ?; s x0 w$ R4 X' Y/ P 3 Bruder SP，Fink DJ，Caplan AI.Mesenchymal stem cells in bone devel-opment，bone repair，and skeletal regeneration therapy.J Cell Biochem，1994;56∶283./ J" N5 x& O; O5 ^# Q2 g
4 Yoo JU，Barthel TS，Nishimura K，et al.The chondro genic potential of human bone-marrow-derived mesenchymal progenitor cells.J Bone Joint Surg，1998;80（12）A∶1745.
( s1 Y4 p2 R7 ?/ z; P3 d7 O% ?7 S 5 鄂征.组织与细胞培养技术，第2版.北京:人民卫生出版社，1995.9.
) O) c+ [$ i/ \) p8 Z$ Z3 D+ s2 x （ 1 四川大学生命科学院华西校区医学生物学与细胞生物学教研室，成都 610041;
+ S8 `8 I5 x# [' _: X 2 四川师范大学生命科学院，成都 610068） |
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发表于 2009-3-3 12:19
发表于 2015-5-29 15:01
