有人做过精子的DNA提取吗？

exin11

我用Qaigen微量血液抽提kit，提了两次，都没有成功。 同时，了解到有人提时加了裂解液。 高手支支招~~

lixiaodong

这个不难，将尾睾（小鼠）剪碎，代组织碎片沉淀后，将悬浮的精子离心沉淀，可以加DTT（2mM）使致密的基因组DNA松散，加蛋白酶K消化（较容易，3个小时以内），其它的步骤与提取组织基因组DNA相同。

exin11

回复 2# lixiaodong , k( u  [+ u3 ^& m
3 ?2 u  e- T2 `( q+ V

7 y9 j6 j3 P% b" I    十分感谢

hjhzhhy

详细方法如下：
- N- X) \  ?& [步骤：
% ~7 c- }4 s  l" _% G4 T8 F7 R5 B
) a/ B, j5 ^3 `& {1、从棉签上取下有检材的棉花并置于1.5塑料离心管中。3 q2 I3 ?* L5 D- ^

+ m/ n+ d# F% l- r( _2、管中加入400微升TNE缓冲液；25%微升sarcosyl（硅鱼精）；75微升水；5微升蛋白酶K溶液手混匀，37度保温2小时。   q# i# v6 u$ f& [! p# h8 b% T; l
1 Z+ p5 B: ]. R( a4 f/ L
3、用一新的灭菌牙签将棉花拧干后管中取出,再用12000rpm离心5分钟。
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4、.移上清液(内含裂解细胞或雌性片段)于一新的15微升管，不要震荡沉淀物（内含非裂解细胞或精子），再用TNE洗脱四次。 6 n0 L, s0 Q2 J2 I% ]: M
. m- u+ g* c  @, @
5、在有沉淀物的管中加入10微升TNE；20%sarcosyl（硅鱼精）；40微升DTT；151微升水；10微升蛋白酶K溶液；手摇混匀，37度保温2小时。

baixueyao029

你可以试试将蛋白酶消化时间延长个几个小时，镜子表面覆盖一层厚厚的蛋白，需要更长时间来消化吧

lixiaodong

楼上提供的可能是法医检测用的Swab样品，可能有体细胞（上皮细胞）的污染，需分布提取。

exin11

回复 4# hjhzhhy 8 L8 |; z( N1 y" R6 d6 O
3 i) {4 x% v. N$ f" R1 C& }2 U

, r/ E; w$ A3 o" E7 k5 R. r    我是做小鼠实验，不是这个啦，谢谢

exin11

回复 5# baixueyao029 3 {2 ^! z3 R' @# W: C  v3 t* i
9 a( V# I5 T( x4 U9 D
: c  v% ^8 K5 p! h& N: d
    试过了，做了个梯度2小时至过夜~~但都不行

exin11

回复 2# lixiaodong
; V! y  X) L2 F# f) j6 c- l* I0 Y- E$ K- c
3 R5 y- m0 [, V" Y; w: q0 N
    问一下，DTT是跟蛋白酶K一起加的，还是先加的，若这样该多长时间？

lixiaodong

回复 9# exin11
' h8 Z+ p4 X# l给你看篇文献吧(有点老，现在网上可以查到类似方法) GermCell-Rossant.pdf (1.58 MB)

2010-8-26 13:58 上传

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。文献中是在精子沉降后重悬时加的，我们作的时候DTT处理半小时，然后就用标准的Proteinase K法提genomic DNA。不用DTT可能也能提出来，用蛋白酶K的buffer重悬精子试试。