|
  
- 积分
- 8
- 威望
- 8
- 包包
- 898
|
作者：杨春 章茜 王书春 韦迎娜 刘廷磊 白琳琳
! ~; W% H& ~8 w" v8 | 9 ^) [, c* y) ?- a; U
+ L: O. q* [6 ^+ V$ s% I) p! M: S
$ H6 L% c3 H& a
6 W- n7 G' z6 f- l% T( z1 K) f: b6 {
9 q$ c9 u' {4 Z
6 Z, x, [% O- f
2 z) T) ]& Y) i
" ~$ v8 D% P' T: ]+ ^ 5 ]( r4 D' F1 ~& t4 B
3 Q9 @2 H. w A# z- h
% e4 V1 d& |; d4 A/ p+ y& N
3 s* {, a, ?/ N. F t
6 q2 N4 Z: z% o( A+ r
. \0 s" K* i4 t: i3 X p& Q, v1 _ . b6 M' z8 m4 ^" P5 m
【关键词】 神经干细胞
* Q& c# f$ q7 F, a: G+ Z1 k# K 【摘要】 目的 探讨神经干细胞移植治疗Alzheimer病（AD）的可行性。方法 采用神经球连续形成法从新生大鼠海马齿状回分离、培养神经干细胞，应用nestin细胞免疫化学方法进行鉴定。神经干细胞经Hoechst33258标记后植入AD模型大鼠海马，4周后，行Y迷宫实验检测大鼠的学习记忆能力，然后取鼠脑进行荧光观察。结果 从新生大鼠海马齿状回成功分离培养了神经干细胞，nestin细胞免疫化学染色呈阳性。与AD组相比，神经干细胞移植组大鼠的学习能力和记忆能力有明显提高。移植的神经干细胞能在海马存活并沿海马回迁移。结论神经干细胞移植能改善AD模型大鼠的学习能力和记忆能力，是治疗Alzheimer病的有效方法之一。 + l) g. C d; p# f1 O D
关键词 神经干细胞 移植 Alzheimer病 大鼠
* l1 F2 {0 r5 v/ ]; B N- oNeural stem cells transplantation to improve! \+ v5 E1 ~" M' k8 M+ `
learning and memory abilities in Alzheimer disease rats 0 @5 i& P4 G+ `! a6 V7 O
Yang Chun，Zhang Qian，Wang Shuchun，et al.+ i+ I: E" z' l
Department of Physiology，Medical College of Zhengzhou University，Zhengzhou450052.
4 p0 W; X/ o$ W【Abstract】 Objective To investigate whether tranlplantation of neural stemcells can ameliorate learning and memory abilities in Alzheimer disease rats.Methods Neural stem cells were isolated from dentate gyrus of hippocamˉpus of newborn rats and were identified by nestin immuncytochemistry.After labered with Hoechst33258，neural stem cells were grafted into the hippocampus of AD rats.Four weeks post transplantation，the rats underwent behavioral testˉing using Y-mazetrial.Fluorescence observation was used after the rats were sacrificed.Results Neural stem cells from dentate gyrus of hippocampus of newborn rats have been successfully cultured and were nestin positive.The rats of neural stem cells transplantation performed significantedly better on measures of memory ability，the Y-maze trial，than did AD rats.Survival and migration of neural stem cells were demonstrated in rats.Conclusion Transplantation of neural stem cells can amelioratememory defects in Alzheimer disease rats.
+ f( v' F8 ^5 x" [) QKey words neural stem cell transplantation Alzheimer’s disease rats
, D: ^5 x. h/ `+ T7 v神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是指具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞能力的，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。目前，人们已能从脐血、胚胎或成年动物的中枢神经系统中成功分离培养出神经干细胞。而神经干细胞的自我更新能力和强大的可塑性，使其成为脑内移植治疗中枢神经系统疾病的理想选材。目前，在鼠类和灵长类动物模型已经积累了移植治疗帕金森病、亨廷顿病、脊髓损伤、缺血性中风等中枢神经系统疾病的大量依据 ［1～4］ ，而对神经干细胞移植治疗阿尔茨海默氏病的研究则较少。2 V w& Q, b9 Y) b" p2 ~/ T9 k
阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease，AD）是中枢神经系统退行性疾病之一，临床上AD患者主要表现为脑认知功能障碍，如健忘、记忆力和空间辨别能力减退以及反应迟钝等，是中老年人的常见病和多发病。其主要神经病理学特征有皮质、海马神经元减少、出现神经元纤维缠结和老年斑。本研究利用新生大鼠海马齿状回分离培养的神经干细胞，移植入AD模型大鼠海马，探讨神经干细胞移植对Alzheimer病的治疗作用。+ Y s: b' ~+ A }+ }
1 材料与方法* @9 Z7 O- s! i, E b
1.1 材料0 E' P6 m- [5 y! k+ q
1.1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠（河南省实验动物中心提供），3～4月龄，体重250～300g。新生SD大鼠（河南省实验动物中心提供）。
! B" U9 G% N6 u4 I/ I5 ^( m; c1.1.2 主要试剂和仪器 Aβ 1-40 、Hoechst33258、DAB试剂盒（Sigma公司），Y型电迷宫（张家港生物医学仪器厂）、大鼠立体定向仪SN-2型（日本TOKYO），DMEM/F12、B27（Gibco公司），EGF（珠海京美生物公司），bFGF（北京邦定生物公司），nestin（北京中山生物技术有限公司），GFAP（BioˉGenex公司），ABC试剂盒（VECTOR公司）。* K% j1 G" s! u- v, f
1.2 方法0 k" C5 t$ J5 w4 Y7 Z
1.2.1 神经干细胞的分离培养及鉴定 取新生SD大鼠（24h内），无菌条件下打开颅腔，Hanks液冲洗脑膜，取整个脑组织置于预先放有解剖液的无菌培养液中，分离海马齿状回，加入培养液（DMEM/F121∶1，2%B 27 ，bFGF20ng/ml，EGF20ng/ml）5ml，制备细胞匀浆，04%台盼蓝染色观察细胞存活率，调整培养液细胞密度为4～5×10 5 个/ml，放入5%CO 2 ，37℃条件下CO 2 培养箱培养。隔2～3d换半量培养液一次。连续培养6～9d，原代神经球形成后，离心收集，机械分离神经球为单细胞悬液，台盼蓝染色计数细胞存活率，以4～5×10 4个/ml分装，传代培养，每2～3d换半量培养液一次。取原代培养和传代培养的神经球滴在涂布有多聚赖氨酸的无菌载玻片上孵育2h后，行nestin细胞免疫化学鉴定:0.3%过氧化氢-甲醇液室温作用30min，0.3%TritonX-100室温透膜处理15min，正常山羊血清20min，滴加一抗（1∶100）湿盒4℃过夜，生物素化二抗室温20min，ABC复合物室温20min，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。4 S8 I! b, j, w! |% S! z
1.2.2 动物分组 Y迷宫筛选对电击敏感并逃避迅速的大鼠随机分成正常对照组、AD组、神经干细胞移植组（简称移植组），各8只。
0 A+ }- L" H9 J( W; Y3 T1.2.3 AD模型的制备 Aβ 1～40 溶于无菌生理盐水（2μg/μl），用前37℃孵育1周以上，使其变为聚集状态的Aβ。AD组及移植组大鼠经10%水合氯醛腹腔麻醉（0.03ml/kg体重），固定于立体定位仪上，参照包新民等的《大鼠脑立体定位图谱》 ［5］ ，选择双侧海马CA1区为注射靶区，于前囟向后3.0mm，中线旁开2.2mm处，用牙科钻钻开颅骨，微量进样器自脑表面垂直进针2.8mm，将Aβ 1～40 5μl缓慢注入（1μl/min），留针10min以保证溶液充分弥散，然后缓慢撤针，所有操作均在无菌条件下进行，皮肤切开处用庆大霉素点滴，缝合切口。常规饲养。正常对照组不施以任何处理。
7 p+ F1 `/ g9 [0 Y( k" {% m1.2.4 细胞标记和移植 第2代培养的神经干细胞用Hoechst33258（10μg/ml培养液）标记30min。将细胞反复吹打使之分散，活细胞计数，离心调整细胞浓度为1×10 5 个/μl。移植组大鼠以制备AD模型同样的方法、同样的位点将5μl细胞悬液注入海马CA1区。AD组则以同样的方法、同样的位点注入同量无菌生理盐水。移植后4周三组大鼠进行行为学检测。1 A; q+ [) E! t4 V' [ I4 ^
1.2.5 行为学检测 ［6］ 采用Y型电迷宫。三臂相互间夹角为120°，臂长40cm，箱底辅以直径3mm，间距12mm的铜棒，每臂顶端有刺激信号灯。实验时，灯光信号示安全区（不通电），安全区的方位随机变换。实验开始时，让大鼠在起步区适应3min，然后予以40V的电击之致其逃至安全区，灯光继续作用15s，然后熄灯休息45s，开始下一次操作。（1）学习测试:规定大鼠受电击后从起步区直接逃至安全区为正确反应，以连续10次中有9次（9/10）正确反应前所需的电击次数（即尝试次数）表示其学习获得能力。若尝试次数超过100次则不再测试，并以100次为最大值计数。并以正确反应数占总测试数的百分比计算正确反应率。（2）记忆再现测试:上述达标大鼠休息24h后，同法检测其记忆 力。以达9/10标准前的尝试次数表示记忆再现能力，并计算其正确反应率。
& z- @, }/ p: M& ^: ^& @$ Y1.2.5 移植细胞的观察 迷宫实验结束后各组大鼠经10%水合氯醛腹腔麻醉（0.03mg/kg体重）后，经主动脉相继灌注生理盐水100ml、4%多聚甲醛（4℃）350ml，快速取脑，后固定，入30%蔗糖溶液，4℃冰箱至组织沉底后做冠状冰冻切片，片厚30μm，荧光显微镜下观察移植细胞的存活情况。
, v+ _3 A; q9 S! C0 X" G1.2.6 统计方法 全部数据用均数±标准差（X±s）表示，应用SPSS10统计软件包单因素方差分析。, g/ B, ^ [. q3 W* @& q
2 结果
4 K! S9 J! j: g1 ]# C" `+ i% g+ O2.1 神经干细胞的培养及鉴定 自新生大鼠海马齿状回分离的单个细胞呈圆形，大小近似。原代培养5d后，培养液中可见悬浮状态的数个到数十个细胞组成的细胞群落，多呈褐色，边界清楚，折光性强，边缘可见细小毛刺，称“神经球”。神经球经离心后重新制备成单细胞悬液，培养2～3d后，可见悬浮在培养液中的单个 |
|
发表于 2009-3-3 12:21
发表于 2015-5-25 13:01
