做MTT遇到的细胞均匀的问题

djl

我最近在做MTT测蛋白促进细胞增殖的实验，对照组测出的结果，有的高有的低（没有污染），老师说我的细胞铺的不匀，怎样才能避免这种人为造成误差的现象。

rmbly

在铺板前，在离心管里面吹打多次（100次左右），然后铺板，我是这样做的，还行。不知道是否帮到你？

why121

消化成悬液后将细胞吸入青霉素小瓶中 分上中下三层吹 用吸管轻柔吹打悬液并旋转小瓶 大概1层吹15-20次左右 然后每种一组重复一次 这样我感觉得到的细胞比较均匀 （个人见解，请多指教）

guosapphire

个人认为有两点你需要验证：
% k) m& ?+ l' x& q' f1 S- i1. 你的培养箱是否水平？培养箱不平会造成细胞铺板不匀。7 M  [% U# ]. Y& _3 ]
2. 细胞移动过程中容易产生相信向心运动，放在培养箱后再做一些震荡可避免这个问题.
7 `6 o) p; L& a; X! \个人认为你消化的的时候不充分造成的可能性比较小。0 u( ?6 _4 Y; F: @% s
希望对你有帮助。

风再吹起

我是这样种的:96孔板，每板做60孔，每孔100微升
7 g6 [; J) l9 F4 f5ml左右的培养液消化1瓶细胞，吹打均匀后计数，7 A3 M; M$ M4 W& Y: D- W0 p
根据计数结果，再次吹匀，均匀分到7ml离心管（种几块板就分几只，这样每板细胞总数就一致），每只0.8、1.0、1.5ml都行，反正最后每管定容到6.5ml（按65孔每孔100微升计）后，就是需要的细胞密度。& `0 Z+ Y# Y  t7 i+ ]8 k4 q0 Z: n% s
吹匀后就可种，竖着分组就要横着种，而且是从1~10然后是20~11的来回种，反之亦然。每种一孔用枪吹3下，每种一行用大枪或吹打管多吹几下，因为细胞沉得很快，最后几行液体不多了可以不用大枪吹了。这样每一孔细胞数就基本一致了。, q1 [' E5 |1 U; Y' }4 R# f- \5 @
种的时候让枪打出稳定、柔和的水流（不能激起漩涡，不然细胞会扎堆），同时转动手腕，贴孔壁画1~2圈，刚好打完100微升，培养液沿孔壁流下，自然就铺的比较均匀了。有人用晃板的方法，个人觉得不适用于96板，后面种完前面一沉底了，晃只会让细胞更扎堆。- w4 I/ T, x; W

5 X8 D( Q# I5 t# H  }要注意的是：7 ?; j  e% J# m, U  y# _- U
每一步都要留余量，比如种60孔，准备好65孔的量，因为没一枪会有误差，只准备60孔，最后一孔细胞会不够。万一出现这种情况，如果细胞瓶里还有，根据稀释比例，还有的补救。
8 m5 t, S' I, J- L# y- h整个过程下来，细胞不知道要被吹多少下，所以吹打要轻柔，不要有泡，还要防止培养液从离心管里吹出来。

djl

回复 4# guosapphire
8 f/ m$ T# i" R, v' G3 ]4 f4 F! v: y& p
3 `; ]- N6 W! e: F& U, L9 z
    谢谢，我们的培养箱确实不平，我每次把板放在中间倒是可以避免细胞分布不匀的现象。我现在最大的困惑是，每孔的细胞个数不匀。以对照组为例，用酶标仪测完OD值，有的在0.3到0.4之间，有的在0.4到0.5之间，或者更高。

djl

回复 2# rmbly 1 w! Q, @/ T$ A- l- p

! U* C, N1 i. D: {' R" ~
4 r* Z1 n. L' M# s' p    谢谢

echo

我个人的经验是每次加细胞时，要每加几孔就充分吹打细胞，同时加液要快。/ h5 F. s8 A! X& s# j
另外，也可以检查一下实验中有没有其他方面出现状况，这样的结果不一定只是细胞量不均匀造成的，比如我曾经遇到过因为移液器出现问题，加液量不均匀引起平行孔之间OD值差别较大。

sailboat

在铺板前，在离心管里面吹打多次（100次左右），然后铺板，我是这样做的，还行。不知道是否帮到你？
4 x; f/ v/ r+ r8 F) _; zrmbly 发表于 2010-9-1 18:32

  x- ^# U/ N) G$ s" \4 F

2 R1 \( G5 Y5 @. y
. O7 L. h: Z2 A4 s5 p    100次？会不会太多了 而且会让细胞受到很大影响

fespysok

吹打的过多对细胞是有损失的，我取心肌细胞铺96孔板时，调整好密度后，分在5ml的离心管中，每管加细胞时适量吹打几次就好了，这样铺出来的细胞还是蛮均匀的！