表观遗传学创新实验

exin11

5’-氮胞苷处理水稻幼苗对基因组DNA甲基化的影响 / p! L1 Q+ \' j5 g) V; ^% P
庞劲松    刘宝
2 k5 Z- J# y( {8 I1 U, U& ^4 g! B1 l% m0 s3 W& k$ v: X

/ P# a$ X& \& I( p% `) z文本内容预览：5 U, Z3 C- t; V' V  y8 N0 \; M
表观遗传学与DNA甲基化7 i: w' I, o' V$ ?- q
DNA甲基化作用' O& Y5 I8 A% i
DNA的甲基化及其方式3 E# V7 i4 f+ `0 Z8 @' j6 ]
DNA甲基化的生物学意义$ k' s- w2 V' Z7 s, u: R% P
DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成
* H# N+ G+ L# [5 N% A) e0 b$ HDNA胞嘧啶甲基化检测; J3 C" d' @, `/ P- [! i
检测方法：MSAP，bisulfite sequencing
  d+ l+ r) Q* j3 b' K# p" |. n5’氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响
/ E  y) g, a+ H$ k( O7 g实验目的9 R) H6 |" z4 F& w) x! w0 E* F
实验材料
0 ^6 V$ _' N  B. B仪器
! L3 y; ?- `! |4 K$ r+ M, F9 X试剂
! n; ^) G! T6 q: S% |0 F# t实验方法" @' a6 o' T- j6 P9 Y
5’-氮胞苷处理水稻幼苗
& U% A& P4 |" s植物基因组DNA的提取与纯化- a1 p. u) v& p2 ?
基因组DNA酶切-连接接头
+ t+ {2 F5 B/ U) c7 ?9 }* k8 yPCR扩增：预扩增，选择性扩增% H$ Q; x, ]# L7 v" o/ S: |
PAGE电泳5 j. E% B8 ?( M) f, w
预期实验结果
1 G8 _  n8 ]3 h/ S* v2 g注意事项与建议
* S/ f/ j1 P8 d! ?) s: a1 i思考题4 }3 z! e3 o2 z! s! j/ R2 i9 V! n
参考文献
, c; c4 a9 r% c" [3 J, g5 |3 x9 W
; y/ F% L( ~* m表观遗传学：
; E2 i. d; F. d7 ]! Y  E不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变；主要包括DNA的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。) |' K* E& p$ w
表观遗传变异包括: X－染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。
  ]" s/ W, G7 R  o$ [表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如DNA甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。7 N: v& `+ N/ b: L& `
DNA甲基化：$ Z: q0 o% w( s, X  R% @
   在DNA 复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化，将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团连接到DNA 分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程。. N8 w5 d" w# {$ k$ y

! o" P6 g8 w) Q6 _DNA甲基化的方式/ y. n" C1 }" ]7 s7 v2 j# W
胞嘧啶甲基化
3 Y* g# }, i& F  V
4 K7 R8 N6 z" A, b5 b3 z4 `6 m5 u- M: z" ~. I
3 d0 Q1 M$ u1 D
腺嘌呤甲基化
" ]: r) I- @9 }, m- T
6 ^  J# i; r7 L' y. E, nDNA甲基化的生物学意义
5 [6 A9 j/ G6 ?影响基因表达状态：通过该表基因调控区DNA甲基化程度调控基因转录
9 s, P' x5 H& f1 ?. [$ W3 X3 R
; X# x5 |, V7 M3 p- i4 P4 V$ F0 C% H9 ?! H2 Z0 r! Z
                                  图3  甲基化与基因沉默
  C$ c4 y9 B* C$ [& a参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源DNA（如转座子）处于沉默状态
2 N* x7 z  G2 _! a提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型
( a( s; Y1 J. L/ _7 P4 p) P- ~
- F) |* K7 M+ L, a+ h1 }1 A5 fDNA胞嘧啶甲基化的种类和形成0 q6 h. z; v+ D" C& A: j7 F* K

2 @0 M8 b" V4 P. W6 i1 b从头甲基化 (de novo methylation)  o2 ]/ `0 Z6 n* A# x% F
DNMT3a，DNMT3b 3 B' l6 \9 {( s! }+ _
在完全没有甲基化的DNA上加上甲基。% N. G% E4 G& T( A* W
! x7 m; E( p) n8 V9 c( W
维持甲基化 (maintenance methylation)
6 ~- ]: ]9 ^5 f# o9 i9 V3 bMet1，DNMT1 & T, e6 ^& s+ ~5 ]+ M5 B8 n
较特异地识别半甲基化状态的DNA，负责% |3 Z8 H8 A( v( ^1 e; s
    在细胞分裂过程中依据DNA母链的甲基化
. U: G& z# u* r3 X! n7 A    状态给新合成的DNA链上加上甲基。
/ U% ?1 W' c. @, _1 b  r# X0 ^  x+ c4 g+ Q, I
                DNA胞嘧啶甲基化检测方法" L& Z( y1 q/ t

) B4 H( |0 w1 b9 q- L6 W. ]使用对胞嘧啶5’-甲基化状态敏感的限制性内切酶进行酶切处理，然后检测多态性：
. q  L6 X- B- n* J甲基化敏感扩增多态性 (MSAP, Methylation Sensitive Amplification Polymorphism)
$ U/ s& ~& q$ h9 w$ {4 m胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序：
7 \4 D$ _; N, }重亚硫酸盐测序 (Bisulfite sequencing)8 B' N$ d* F# k/ V% S3 G/ T2 |
   GCmTACT   重亚硫酸钠   GCmTATT
! b7 _, p& H& `% j" e" B1 O         测序                            测序
$ ^2 ~& u/ _" p. j  p8 K4 l此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，CpG岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等 1 _+ [; c$ A/ @' M2 \. l! t! P

& N( g& `! Q; d) TMSAP
, w. l. j7 J4 t* m  O% A用途：
/ v# F2 S7 P% X  S" D$ @; U  N最常用的大规模检测基因组甲基化变异水平和位点的手段
6 [) C( w9 _, F$ @3 t9 R原理：( x% L5 G. M) _- C+ O
利用对DNA甲基化敏感性不同的同裂酶分别切割DNA，产生不同的酶切产物，同时将酶切产物添加接头，然后进行PCR扩增、PAGE电泳、银染，产生可见的具有不同酶切型式的谱带，即可得知DNA甲基化信息。
2 g2 W6 ^. I, X7 r  Z) Z甲基化状态分析：
1 r& f8 b  F5 S* |在不同泳道相对应的位置上，如果Msp I酶切产物有扩增带、而Hpa II酶切产物没有扩增带的，说明此处的序列是CCmGG；若都有扩增带，说明此处是CCGG。还可以进一步对差异条带进行切胶回收、克隆、测序，以便得知发生甲基化变化的胞嘧啶的具体位置。7 k; q2 r  Y5 W+ o' w

3 v7 L: U. U( F6 [表1  甲基化敏感酶对不同甲基化状态DNA的切割结果" u, O5 m9 g. B! \

* \% X# b- L* H# S" v8 `0 p) {  ^8 @MSAP流程：) }/ ^8 ]! n! S

" E4 ^- g. X' o5 @" A
- }8 I* e+ F/ @! P# m; _                                                       提取基因组DNA
0 Q$ ?- Y4 _5 [5 O7 d                                                             （注意发育时期和成长状态相同）1 S0 Q4 ]( Y* t
                            ………ATCCGGTGGCTTGCCmGGAC……
) {" T4 [( R8 N' J. \" d0 J                            ………TAGGCCACCGAACGG   CCTG……' v$ u, `& T' y; O. a4 ]$ `1 C
                      Msp I 酶切+接头                                   Hap II酶切+接头$ f: j1 s  u- e7 Z+ f1 z' K
ATCC  GGTGGCTTGCCm  GGAC                 ATCC  GGTGGCTTGCCmGGAC
* l; a' N! \7 {+ t; y& OTAGG  CCACCGAACGG    CCTG                 TAGG  CCACCGAACGG  CCTG
) j0 o$ u! _( z' w' a5 m4 O' B5 B# c, T
                           PCR                                   PCR
  A! h; p3 l# m0 K9 \/ v8 D
* ~4 T3 |* ~* q( [& p                          PAGE电泳                               PAGE电泳
, c/ y6 l, G/ S" H0 S
% {: w3 V% i- C1 z& f: g4 l5 h1 i/ Y重亚硫酸盐测序8 _6 `9 X) r6 t: h0 l, V
. o5 a# b+ i' d# b3 p# ?' y
实验目的
% U7 O% s7 f9 r使用不同浓度的5’氮胞苷溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使其基因组DNA胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用MSAP方法检测DNA胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因DNA甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗传表型。+ [. l9 k. h3 G; F) y" W" m( Q

& M/ I+ h* \: B* S实验材料
& n& l1 L8 Q- f7 P. p水稻：日本晴 (Oryza sativa var japonica, nipponbare)
$ w9 y) j) O+ t, T+ }
$ t) s! e8 N& s7 c6 o        5’氮胞苷如何影响基因组DNA甲基化水平： 5’氮胞苷可以与DNA甲基转移酶（DMT）结合从而抑制其活性，在DNA复制过程中抑制维持甲基化作用，使复制后的DNA甲基化水平降低。0 Q- V6 g7 o; z, \; ^0 M+ ~
所需仪器
, \1 T- @$ @5 o* F离心机          PCR仪         气浴摇床        水浴摇床       植物生长箱
9 |7 l9 ~3 J0 z- d% \
( v! w: ?! P  j  _, f8 I# |) E. ^3 O9 [- ]! H; h  r

% }: L" J; o4 y, m2 v6 A! s; n" I2 T- Z

6 s0 Y* S, K: j( ~1 ?2 N9 q  电泳仪        电泳槽        微量移液器         紫外分析仪   分析天平
: a6 F1 J8 R/ N9 R& l0 k5 V& U2 V: h
( L# b4 P: ]+ E- x; o/ d试剂3 `' [+ L& \- H9 L  G' N
植物基因组DNA改良CTAB提取液：
, X3 M: `  s+ Z6 jbuffer A: 0.35mol/L Sorbitol，0.1mol/L Tris-HCl pH7.5，0.5mmol/L EDTA;
1 v8 }/ V, H8 q, p" ]/ \% Lbuffer B: 0.2mol/L Tris-HCl pH7.5，0.05mol/L EDTA，2mol/L NaCl，2%CTAB;
4 s2 b4 e9 Y5 ?" R/ r2 T+ vbuffer C: 5%N-lauroylsarcosine" \' H& {( z3 {5 W5 J6 K8 t) @+ }$ ~
PCR试剂：Takara rTaq，10X PCR buffer，ddH2O，
. v; F& K+ j0 nPCR引物
" P; t' P; r! F预扩增引物：# v5 Y$ E2 X  c4 l2 f6 M
                        H/M+0: (5´-GACTGCGTACCAATTCA-3´)  u7 Y. q8 t! D0 U8 {) z
                        EcoRI+0: (5´-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3´)
' {) O: M; K; i. ?, J1 Z6 t选择性扩增引物：
- O+ H2 v* R! H, c; A/ @                        H/M+AN: 5´-GACTGCGTACCAATTCAA(T, C, G)-3´
4 r  E8 C/ R( D' T                        EcoRI+AN: 5´-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T, C, G)-3´。
1 O/ d/ X3 J; l' A, c3 n5 c酶切-连接试剂：EcoRI (NEB)，Hap II (NEB)，Msp I (NEB)，T4 DNA ligase，T4 10 x reaction buffer
2 ]4 Q; e- ]2 ]# s$ t! h接头：EcoRI adapter: 5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’      
8 U5 \2 f9 V" O0 d) \! W                                                  CATCTGACGCATGGTTAA * Q/ a% K( }# E, Q0 j+ k( e
                        HapII/MspI adapter: 5-‘GATCATGAGTCCTGCT-3’
+ ^" k; v! q* M  @                                           AGTACTCAGGACGAGC
" |$ g9 m  ]2 z7 E% ^( `PAGE试剂：聚丙烯酰胺，尿素，AgNO3，Na2CO3，溴酚蓝， 2 u/ B( F  m4 x6 z# W" R
; I; Y( m- y: }6 n2 K: ?8 G/ m9 \
银染固定/终止液  (10%冰乙酸)，染色液 (2升双蒸水预冷，用时加2克硝酸银，3ml 37%甲醛)，显影液 (2升双蒸水中溶解60克碳酸钠，冷却至10-12ºC ，用时，加入3ml 37%甲醛，400ul硫代硫酸钠（10mg/ml）)。
& D5 D2 h4 A2 w" T$ O3 S3 R其它试剂：5’-氮胞苷(100mg/mL)，蒸馏水，PVP (20%)，氯仿:异戊醇(24:1)，异丙醇，70%乙醇，RNA酶A (DNase-free)，TE，TAE，琼脂糖，EB，未酶切的λ DNA， 1xTBE (0.089M Tris-borate, 0.089 M Boric Acid, 0.002 M EDTA) ， 3x loading buffer (300 mM NaOH, 97% formamide, 0.2% bromophenol blue)。
* P- F! O9 Q0 m实验方法
+ U9 {% h2 [5 V5’-氮胞苷处理水稻幼苗：26℃，暗培养
2 s# k( Q0 h4 p" f" o7 X% K(1) 取水稻Nipponbare种子10粒X 4组，分别置于90mm培养皿内的双层滤纸上，加入15mL蒸馏水浸种24h；（第一天）
- ]3 w- V1 d; `& a5 U0 @4 l(2) 分为三个实验组和一个对照组，实验组分别用25mg/mL, 50mg/mL, 100mg/mL5’-氮胞苷溶液处理，对照组用蒸馏水培养，共处理10天，每天换处理液1次；（第二~十一天）; c- w6 L+ w+ x. @7 n7 x  O

& a4 G, v' [9 G/ Y$ `植物基因组DNA的提取与纯化
8 H7 t+ f& S" N( D7 H改良CTAB法(Kidwell and Osborn, 1992)3 K( [6 r" [6 j7 K& k' c6 N' a0 {" M
        不同处理的叶片1g
+ z7 ?! z6 B, A$ k                        液氮中研磨成粉
1 v% ?) O& Z# B7 v        转入50ml离心管& O" B* g" o, f7 F6 r0 T, G
                        加入等体积DNA提取缓冲液(A:B:C=1:1:0.4混合，加1%PVP于B液): Z. X, _1 \+ x$ Q
                         65℃恒温水浴摇床，40-50rpm振摇90分钟
/ @. _" b: G4 W2 P                        加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒10-15分钟
" d" P2 t+ I: `6 U                        4℃3000rpm离心10-15分钟% R+ c$ m* V8 H  |6 ^, l# W" v! N/ t
                    上层水相
) M. P4 w* `+ e5 f3 R/ H. i                        加入2/3体积的预冷异丙醇，上下颠倒5分钟并置4℃冰箱内10min
+ a  a- ^3 Y2 A! @4 a+ Q* J# `: A: F                        DNA沉淀后于4℃3000rpm离心收集DNA于管底
* m/ z$ q0 Q3 a1 S) X                        DNA于70%乙醇中过夜。/ x8 x' P6 S8 L+ T4 Y
                    DNA沉淀6 u  `$ w- o! `0 P- l6 m
                                                                 （第十二天）; `0 a6 R- T9 V2 z/ Q% {
* @2 a$ @+ S- H2 R  x
                        风干DNA
* y4 v; W$ d) k2 o; z+ [3 J: U                Genomic DNA4 ?( v3 T/ X2 m' i: }: }* |# _
                        2ml Eppendorf中加1ml TE溶解沉淀
: K4 r9 ]* {# \& B: {                        待DNA完全溶解后，加入5μl不含DNA酶的RNA酶，37℃保温30                        分钟以除去DNA中的RNA。
: X, f! Q; _# K. j                        加入等量氯仿:异戊醇(24:1) 纯化DNA，轻轻上下颠倒10-15分钟2 T& R9 p' p+ q  k& ^; X
                        4℃3000rpm离心10-15分钟0 `- }4 C6 V9 g! B
                   DNA沉淀  V% C; h  p0 B2 b  E
                        70%乙醇过夜洗涤DNA( a0 F6 Y% U1 p7 ?3 c- {; B
                        溶于DNA于200-500μl TE中# a5 T6 e4 P  E/ F- b/ y' X0 N
                Genomic DNA溶液, q9 u5 D) n% S" L' O1 c6 J
                        0.8%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量并据已知的DNA Marker                        （未酶切的λDNA）估计其浓度。9 I- J5 X+ X8 B" f8 |: d
                        调整DNA浓度，置於-20℃备用。 % Q0 T3 c  W4 C. G% D

! r/ ?; Z& r( v4 {  _基因组DNA酶切-连接接头
0 f1 A( n1 R+ Y, y) u7 v' w2 w7 c甲基化分析采用两种甲基化敏感酶HapⅡ和MspⅠ（NEB）。在限制性酶切和连接前，先把两个单链的接头复性为双链结构(序列见试剂部分)，即100℃变性5分钟, 缓慢冷却至室温，-20℃冷冻保存备用。; T! I- A$ f4 H& c5 n
水稻MSAP限制性酶切和连接体系如下：
7 V, R; K4 u1 Z! t2 \! E1 u
- \# s' y& y: ^9 _1 QPCR扩增  E  _5 T& {/ I, c
预扩增：水稻AFLP预扩增体系如右表(预扩增引物PCR引物部分)： * N; o0 p8 `4 @0 W
混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：
; [% i' V. w# ?2 w3 w: H3 q+ {/ Y; V$ ], ?. a/ f1 H$ g
3 C# w- w7 F( B$ Y/ b% j1 b% y
: k" w' j/ b/ s! ^( w, w, D' C' @; ]
/ Z3 d4 q% e3 s9 d+ N$ }* N

- p7 i6 N% w1 }4 b
% O& C4 v; d$ r/ t; R1 P) p. l9 Z$ W( |

) }4 m8 N# V7 c0 r
6 g: ^9 v& P2 H9 e# }* o  {" u# B% k7 N! ?( _% Q2 s) q
PCR程序：94℃ 预变性2min, 94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸60秒, 共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。
% B' W' a$ O6 {4 I: [根据检测结果，用0.1x TE buffer稀释预扩增产物1/10~1/40，作为PCR选择性扩增的DNA模板。' {+ S2 y8 J9 E9 q# v
& q2 i8 ^: P9 ]* s5 G" q
水稻AFLP选择性扩增体系如下： : l2 K4 N; H$ B/ s' I# g' |" J

0 p# |* m& N0 \6 ~0 x( q0 y0 w# Q7 P+ F3 _, K0 }: ~. \

7 U$ o# ^; \: y! E' h, V/ q
* |2 T1 [, A* b1 ]/ s
0 K2 p3 `$ J4 [
' p3 n5 ]# i+ i1 a4 H
/ z) u4 j1 e5 o9 M+ o+ O按以下参数进行PCR扩增反应：
5 g, |) c# ~. c6 u2 Z) n3 G- }        94℃ 预变性2分钟, 94℃变性30秒，65℃复性30秒，72℃延伸80秒，以后每轮循环温度递减1℃，扩增10轮。接着94℃变性30秒，  55℃复性30秒，  72℃延伸80秒，共进行40个循环，最后72℃延伸10分钟。                    （第十七天）" l2 \7 c, P* F- [6 i. v6 n& k+ \
% ~5 l% i# C0 z( ]$ ]/ Q: |
PAGE电泳( G5 A; V: ^  K7 R7 E/ t7 S
电泳装置图; |) K9 y1 X# A, M8 y5 c1 r$ P

- u" A: q* Z# B7 g- s玻璃板分为大板和小板(上部凹形) 。
  u8 E3 V2 X$ p' o+ h        自来水清洗
# N( h" m6 |: v* Q  X) o) K* K
5 D+ h: `+ L  i1 [0 R        95％酒精擦两遍
3 o+ V: u0 `: E
0 }% t4 G8 J; Y' J. F" B        硅化：均匀擦涂亲和硅化试剂于大板的一面，剥离硅化试剂于小板的一面
$ ?6 U1 S; T" o0 j- d1 B: e
( ~( k5 D! i7 w: t) \, o        5分钟后，95％酒精再擦两遍，  B/ P# D3 T( B2 U8 s! l' n
8 `: s2 S5 i6 M  M8 M, P" }
                     装板7 x3 S. J0 ^! D& b" c

) \! {0 w  k+ p5 v: m! A: |% ~                     灌胶
0 N% [9 F3 M& x$ o5 {3 `
7 v5 M! a  A# v5 m4 m# \尿素-PAGE胶配制' T$ Z0 Q" H+ z, w. O3 `

7 y# g6 r9 r% _6 t- C- d# X
4 G" z- p( W3 [& e! P  P0 Z
2 j( @3 a6 x1 s% d5 R2 ?( f' D8 I. s% n. c
        灌胶前，加入四甲基乙二胺（TEMED）30μL，10%过硫酸铵（APS）160μl，混匀，立即灌胶。灌胶时玻璃板倾斜15度。胶聚合1小时以上才可以电泳。
  k- m/ g! T' T7 e# I电泳：电泳仪采用北京市六一仪器厂DYY-10C型。电泳装置使用北京君意东方电泳设备有限司测序装置新JY-CX2B型。电泳缓冲液为1xTBE ，85W预电泳1小时，胶板的温度达到55˚C。点样前，DNA样品95˚C变性5分钟，立即冰浴，加3x loading buffer, 混匀，瞬时离心，点样量16μL， 恒功率55W电泳到指定位置，即可卸板染色。
8 j3 c, O0 D3 t# V4 L$ e- `8 ?" }2 O3 p
银染操作" ~3 ^# k! o- |0 M7 D9 r3 M( w
电泳结束后，轻轻分离两块玻璃板，将
4 \  I! e' z: W- t        附着胶的大板置于固定/终止液中，轻摇7 b! e. ]/ \* q: {4 H1 u
        20分钟，直至指示染料消失。
* G) b+ D1 l$ b( T; P* E凝胶洗涤，回收固定/终止液，用双蒸水
) |2 I/ S& ?6 v6 c, L/ X        洗涤凝胶3次，每次至少2分钟，凝胶板
7 B' p. s% y0 f: z* G        从水中取出后，竖起空水15秒。
( g2 n$ V4 ~; J$ `) J# J& B染色，将胶板移至染色液中，轻摇30分钟。
. @# z3 @2 V! N8 d7 i/ j: ?! `4 ^  c凝胶显影，将染色后的胶板放入双蒸水中5-10秒，迅速取出并竖起控水，随后把胶板放入预冷的一半显影液中，充分摇动，当出现第一批条带后，倒入另一半显影液，轻摇至条带全部出现。（注意：从放入水中到放入显影液中，时间不应超过10秒。）* D& A% g- v: }" Q
终止显影，在显影液中直接添加等体积的固定/终止液（第一步中用过的），停止显影并固定影像。0 f% Y  l$ y6 G
固定完全后，即醋酸和碳酸钠反应完全(溶液不再有二氧化碳产生)，用双蒸水洗涤凝胶2次，每次至少2分钟，凝胶板从水中取出后，竖起控水凉干备用。                          （第十九天）
7 w! P, o+ z2 W: R1 ]- _( A! p9 Q
预期实验结果0 A/ u4 s  s9 R! V- t& s7 `
同一位置处不同样品电泳条带的不同，显示此处胞嘧啶甲基化状态不同。                                        （第二十天）) W1 V# }& X; S: a

  H+ p) @9 ?% W  }6 P注意事项与建议2 ]# `; x5 y, U
五氮胞苷（5-azacytidine；MW:244.21）：粉末于-20℃保存，见光或遇热分解，使用时配母液于4℃保存，保存时间不宜超过半个月；
3 K1 `- W+ F2 l+ {9 n丙烯酰胺为剧毒试剂，配制、使用时必须按有关规程做好个人防护；: k; Z+ V+ ~9 a" `$ h4 u1 b' W$ s
思考题
( G5 b9 k+ X& o. d" I3 s0 r5’-氮胞苷为什么能使DNA甲基化水平降低？" {" T/ O' [; {, Z& \, V6 `7 N
MSAP的原理是什么？, x2 }* H3 a/ \; k% P; Z9 L
如何分析MSAP电泳图？
; q* H8 ^) K& m/ q6 z+ Q9 {3 e" V  s参考文献 1 r, W$ d, n5 n
[1] Razin A, Cedar H. DNA methylation-Biochemistry and Biological Significance. J Chromatogr, 1992, 581(1): 31-40.
" }: x4 A, j' s! r* x[2] Flavell R B. Inactivation of gene expression in plants as a on sequence of specific sequence duplication. Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 91:3490-3496.! r. N* M- `9 A
[3] Ng H.H, Bird A. DNA methylation and chromatin modification. Curr Opin Genet Dev, 1999, 9(2): 158－1630 r, I* B9 {' a
[4] Stokes T. Methylation of a different kind. Trends Plant Sci, 2001, 6(11):503-512.

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exin11

回复 5# wxl87 ! g, |, v1 r' M0 Y
5 C3 I& L* L' C, }  g) l/ X

8 u, Z# V4 R& `- i   还行吧，相互学习咯。我看看哈

wxl87

回复 4# exin11 1 {3 E; J4 i+ _
* w, y* S1 Q4 ]% p
7 H4 K# w6 M1 ?2 ]
    你对甲基化了解吗？我这有篇帖子是问的关于甲基化的问题，你看看能否解答。谢谢。
/ q0 G0 W$ l  z! J' v+ Z. }http://www.stemcell8.cn/thread-26667-1-1.html

exin11

回复 3# wxl87 0 W5 a* t* h0 \! n
/ e1 l. b, ~; P6 M' H: @( c6 {1 h
) V" X' N" `$ O' [8 J3 ?
    嗯嗯，我就是想不通为什么没人来讨论呢，谢谢你

wxl87

学习甲基化，目前表观遗传-甲基化的研究挺热门的，动物方面的更多了。

exin11

大家来看看，相互学习，留下简单的一笔，版块就会活跃不少，论坛也会活跃不少！o(∩_∩)o
2 z. ~, a) X0 g6 d3 K学海无涯，多学一些，有好处不是吗？