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发表于 2010-9-2 18:23 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

5’-氮胞苷处理水稻幼苗对基因组DNA甲基化的影响
庞劲松刘宝
% r* x  I# w. j  R

文本内容预览：9 o0 `- z; S: c' l0 U" W# @" G
表观遗传学与DNA甲基化7 N& [& ~2 }7 D% m. S, j
DNA甲基化作用- E, U9 @& S8 S7 U8 W9 }8 b! y
DNA的甲基化及其方式0 z5 L  E2 V& [$ ~% A
DNA甲基化的生物学意义
DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成" A# A; K" ^7 k0 }/ V" {. N! {3 `
DNA胞嘧啶甲基化检测
检测方法：MSAP，bisulfite sequencing
5’氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响; G! Q$ {, |& R1 q5 {5 k( ~
实验目的% x" n/ q+ L0 B9 f0 F4 q/ t
实验材料' p# v$ L- \/ l* m
仪器
试剂
实验方法
5’-氮胞苷处理水稻幼苗/ S  l7 w0 [3 n
植物基因组DNA的提取与纯化, m; J8 h( M, q& J, G8 p1 ?7 ~* o
基因组DNA酶切-连接接头/ u$ n, U. @' L7 i6 N; C& G5 Q
PCR扩增：预扩增，选择性扩增
PAGE电泳. ^8 G; ]! D/ R/ c: Q' x
预期实验结果; V7 w9 E: z: `* ^* Q8 V; n
注意事项与建议$ X0 K0 O) c, G/ _1 L+ k# @5 S
思考题" K, K5 P) y/ N. \( d9 G$ w5 J" I
参考文献7 p7 x; ]* i- r: l
5 N( L$ U4 m6 L% ~8 K* X& r
表观遗传学：) Q0 I% J7 c' m
不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变；主要包括DNA的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。
表观遗传变异包括: X－染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。
表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如DNA甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。
DNA甲基化：
在DNA 复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化，将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团连接到DNA 分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程。
5 ~) r+ |2 g, q4 @  N' y! `
DNA甲基化的方式
胞嘧啶甲基化

' y1 `* i( i! t9 C
腺嘌呤甲基化
$ z7 F! _% O& H# Q; A& L* f- y
DNA甲基化的生物学意义
影响基因表达状态：通过该表基因调控区DNA甲基化程度调控基因转录3 u; r! S; ^- P4 H

                              图3  甲基化与基因沉默6 q9 I4 ]. p8 r6 `5 i. ^
参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源DNA（如转座子）处于沉默状态
提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型
0 d# S$ z" n/ W; g
DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成
: z- I$ a+ _$ G! A/ J
从头甲基化 (de novo methylation)
DNMT3a，DNMT3b + y& t. y& V+ S* x& [
在完全没有甲基化的DNA上加上甲基。! d  I: n) A# O7 a4 Q3 E

维持甲基化 (maintenance methylation)
Met1，DNMT1 , @& ~5 y9 d- S+ n6 H! }
较特异地识别半甲基化状态的DNA，负责
在细胞分裂过程中依据DNA母链的甲基化
状态给新合成的DNA链上加上甲基。2 z2 H1 Z$ ~% d- {% W5 i

            DNA胞嘧啶甲基化检测方法

使用对胞嘧啶5’-甲基化状态敏感的限制性内切酶进行酶切处理，然后检测多态性：; s- u/ L! B+ U  E2 e7 s& {' C
甲基化敏感扩增多态性 (MSAP, Methylation Sensitive Amplification Polymorphism)% S1 \! x/ }' ]6 ~  t) b7 d
胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序：2 Z% a( E7 x3 k. p; [
重亚硫酸盐测序 (Bisulfite sequencing)
GCmTACT 重亚硫酸钠 GCmTATT; }  ^4 @( f6 w' g6 _
      测序                         测序
此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，CpG岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等 2 s- N5 A$ T2 ?4 R. d

MSAP
用途：* q) s' }" I: H, z( Z- V
最常用的大规模检测基因组甲基化变异水平和位点的手段
原理：4 [1 K  Y! I  Y
利用对DNA甲基化敏感性不同的同裂酶分别切割DNA，产生不同的酶切产物，同时将酶切产物添加接头，然后进行PCR扩增、PAGE电泳、银染，产生可见的具有不同酶切型式的谱带，即可得知DNA甲基化信息。
甲基化状态分析：; H  U- q- k; q3 Y4 s" f: c
在不同泳道相对应的位置上，如果Msp I酶切产物有扩增带、而Hpa II酶切产物没有扩增带的，说明此处的序列是CCmGG；若都有扩增带，说明此处是CCGG。还可以进一步对差异条带进行切胶回收、克隆、测序，以便得知发生甲基化变化的胞嘧啶的具体位置。" p! C! K5 s; f- d6 ~+ _, z. E/ @
. x2 |4 G0 w" m' c& T2 l. }
表1  甲基化敏感酶对不同甲基化状态DNA的切割结果

MSAP流程：( l# P% O' }* q& }$ B, k/ j
% @3 F+ v$ [1 {

                                                   提取基因组DNA
                                                         （注意发育时期和成长状态相同）3 V1 b( f5 H* @
                        ………ATCCGGTGGCTTGCCmGGAC……
                        ………TAGGCCACCGAACGG CCTG……
                  Msp I 酶切+接头                                  Hap II酶切+接头
ATCC  GGTGGCTTGCCm  GGAC                ATCC  GGTGGCTTGCCmGGAC% [) ^% G! @$ B/ A, G4 l
TAGG  CCACCGAACGG CCTG                TAGG  CCACCGAACGG  CCTG3 a$ f* u4 U5 J! L$ c* d
5 n7 R" n2 E. `1 Y: U2 u" U6 D
                        PCR                                  PCR' A$ p- b) C" L: B7 _

                        PAGE电泳                            PAGE电泳( ]7 `2 a5 A: {3 B( E1 h
4 p. w# `9 M& V/ {' k/ y' T- Q
重亚硫酸盐测序

实验目的
使用不同浓度的5’氮胞苷溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使其基因组DNA胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用MSAP方法检测DNA胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因DNA甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗传表型。

实验材料( q9 o  o( A8 d+ y% N; b6 m; T
水稻：日本晴 (Oryza sativa var japonica, nipponbare) ; z# D; ]! p* }( p$ D2 e
( f  X% U, t* f# A* {3 i/ v# b4 b
      5’氮胞苷如何影响基因组DNA甲基化水平： 5’氮胞苷可以与DNA甲基转移酶（DMT）结合从而抑制其活性，在DNA复制过程中抑制维持甲基化作用，使复制后的DNA甲基化水平降低。
所需仪器0 R" U* R1 d% X& t: M- z# w" r
离心机       PCR仪       气浴摇床       水浴摇床    植物生长箱

  电泳仪       电泳槽       微量移液器       紫外分析仪分析天平
, c$ u9 q( ?, T, ^$ c/ P# j
试剂+ C! j9 R% p, |- c/ {0 a! L
植物基因组DNA改良CTAB提取液：
buffer A: 0.35mol/L Sorbitol，0.1mol/L Tris-HCl pH7.5，0.5mmol/L EDTA;7 d& t  r! _$ E' ~  r! O
buffer B: 0.2mol/L Tris-HCl pH7.5，0.05mol/L EDTA，2mol/L NaCl，2%CTAB;0 v+ w5 Y5 I7 M" t& a# D/ ~0 o
buffer C: 5%N-lauroylsarcosine
PCR试剂：Takara rTaq，10X PCR buffer，ddH2O，
PCR引物/ J: b6 M8 d' j% }) X7 ]. c
预扩增引物：
                     H/M+0: (5´-GACTGCGTACCAATTCA-3´)0 m1 W. h- Q2 y
                     EcoRI+0: (5´-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3´)
选择性扩增引物：' x' ^! l5 k. p
                     H/M+AN: 5´-GACTGCGTACCAATTCAA(T, C, G)-3´( Q8 B9 b" Q( `1 n# r
                     EcoRI+AN: 5´-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T, C, G)-3´。8 a9 B3 n- N6 s- J! A3 t7 ?
酶切-连接试剂：EcoRI (NEB)，Hap II (NEB)，Msp I (NEB)，T4 DNA ligase，T4 10 x reaction buffer
接头：EcoRI adapter: 5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’
                                                CATCTGACGCATGGTTAA 4 T# A, Y- }2 z2 ~6 e; I3 |6 k
                     HapII/MspI adapter: 5-‘GATCATGAGTCCTGCT-3’  Y. B! h, Q5 o  X$ n! j1 }* }
                                       AGTACTCAGGACGAGC
PAGE试剂：聚丙烯酰胺，尿素，AgNO3，Na2CO3，溴酚蓝， , W& b4 c# i' r% @
& y8 K! z  J+ _+ D- s& B
银染固定/终止液  (10%冰乙酸)，染色液 (2升双蒸水预冷，用时加2克硝酸银，3ml 37%甲醛)，显影液 (2升双蒸水中溶解60克碳酸钠，冷却至10-12ºC ，用时，加入3ml 37%甲醛，400ul硫代硫酸钠（10mg/ml）)。
其它试剂：5’-氮胞苷(100mg/mL)，蒸馏水，PVP (20%)，氯仿:异戊醇(24:1)，异丙醇，70%乙醇，RNA酶A (DNase-free)，TE，TAE，琼脂糖，EB，未酶切的λ DNA， 1xTBE (0.089M Tris-borate, 0.089 M Boric Acid, 0.002 M EDTA) ， 3x loading buffer (300 mM NaOH, 97% formamide, 0.2% bromophenol blue)。 " v0 h6 X/ K- _1 {) ]2 y, ]. ?
实验方法  ^2 F) h' m2 A
5’-氮胞苷处理水稻幼苗：26℃，暗培养
(1) 取水稻Nipponbare种子10粒X 4组，分别置于90mm培养皿内的双层滤纸上，加入15mL蒸馏水浸种24h；（第一天）4 Q  W  a$ K: f# l1 y) ~
(2) 分为三个实验组和一个对照组，实验组分别用25mg/mL, 50mg/mL, 100mg/mL5’-氮胞苷溶液处理，对照组用蒸馏水培养，共处理10天，每天换处理液1次；（第二~十一天）# }6 e+ J7 |% M+ y2 |& l
, F, @- h3 d0 J' u8 Z- |$ T  t, Y8 V
植物基因组DNA的提取与纯化! ]( u$ z) s2 {7 g9 D! h
改良CTAB法(Kidwell and Osborn, 1992)
      不同处理的叶片1g
                     液氮中研磨成粉& S) i: k) |# ?$ F' n. x
      转入50ml离心管
                     加入等体积DNA提取缓冲液(A:B:C=1:1:0.4混合，加1%PVP于B液)
                     65℃恒温水浴摇床，40-50rpm振摇90分钟
                     加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒10-15分钟
                     4℃3000rpm离心10-15分钟
                  上层水相
                     加入2/3体积的预冷异丙醇，上下颠倒5分钟并置4℃冰箱内10min2 T  m: G6 s1 s( G1 M
                     DNA沉淀后于4℃3000rpm离心收集DNA于管底
                     DNA于70%乙醇中过夜。) g) R  }% H' B8 ~8 L5 w$ K
                  DNA沉淀$ J6 r0 p0 A+ T
                                                               （第十二天）/ E! W( }6 m. V) S

                     风干DNA% |8 [  q4 [  B0 X# U" Q
            Genomic DNA
                     2ml Eppendorf中加1ml TE溶解沉淀  U7 B, \: P8 F1 o( ^9 I! l) U8 U
                     待DNA完全溶解后，加入5μl不含DNA酶的RNA酶，37℃保温30                      分钟以除去DNA中的RNA。
                     加入等量氯仿:异戊醇(24:1) 纯化DNA，轻轻上下颠倒10-15分钟2 b+ Z1 j2 |( k  o
                     4℃3000rpm离心10-15分钟( _  B7 B6 G: d0 Q# c: q3 O/ e
               DNA沉淀
                     70%乙醇过夜洗涤DNA9 n$ x8 d. ]* D$ O0 l, U/ \+ b
                     溶于DNA于200-500μl TE中
            Genomic DNA溶液
                     0.8%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量并据已知的DNA Marker                      （未酶切的λDNA）估计其浓度。. T8 w% s' d; i2 `' h2 k' J
                     调整DNA浓度，置於-20℃备用。

基因组DNA酶切-连接接头/ F) c5 |! n* k% f0 q
甲基化分析采用两种甲基化敏感酶HapⅡ和MspⅠ（NEB）。在限制性酶切和连接前，先把两个单链的接头复性为双链结构(序列见试剂部分)，即100℃变性5分钟, 缓慢冷却至室温，-20℃冷冻保存备用。
水稻MSAP限制性酶切和连接体系如下： : U( D0 U! p2 r

PCR扩增
预扩增：水稻AFLP预扩增体系如右表(预扩增引物PCR引物部分)： ( ~- \/ _( t3 D
混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：

4 f! {1 ^% }! i; H: ?! z' B
6 L* ~. R- z( ]" j! v
2 S8 k7 A9 ]% \4 \, Y6 v$ D9 F
. z7 n/ m5 Q' a$ F% O
2 u4 [! x. g/ T

# q' _8 u( d. R5 p* a0 D
PCR程序：94℃ 预变性2min, 94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸60秒, 共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。3 p, n; }- u: r1 j
根据检测结果，用0.1x TE buffer稀释预扩增产物1/10~1/40，作为PCR选择性扩增的DNA模板。

水稻AFLP选择性扩增体系如下：
* K- z- R% n# x' Z  D' a9 ]

! J* \/ B0 U" Y* Q6 I6 Z% r

: R9 p5 w* i8 E+ |
  a2 H" [# N% i; J6 Y
. L# v; g- ~8 y* j9 k) C8 J
按以下参数进行PCR扩增反应：
      94℃ 预变性2分钟, 94℃变性30秒，65℃复性30秒，72℃延伸80秒，以后每轮循环温度递减1℃，扩增10轮。接着94℃变性30秒，  55℃复性30秒，  72℃延伸80秒，共进行40个循环，最后72℃延伸10分钟。                   （第十七天）

PAGE电泳
电泳装置图7 {9 o2 f3 @3 c) A* d" c! H: ]; k
- P: U8 j; Y+ B& l6 S
玻璃板分为大板和小板(上部凹形) 。. n* k' @, F7 L/ s/ |
      自来水清洗9 @7 p! S6 k% j+ T

      95％酒精擦两遍+ p7 s& g8 W5 U8 x" d

      硅化：均匀擦涂亲和硅化试剂于大板的一面，剥离硅化试剂于小板的一面
; S! z3 K' y* \+ C
      5分钟后，95％酒精再擦两遍，7 }" B' y/ L1 W+ W, H# Z
# o3 X$ F" s; N5 N" s
                  装板

                  灌胶
2 }; N3 F$ `$ E+ y* C
尿素-PAGE胶配制9 ^, T4 S( M; c" \1 i: z: |0 c8 C

      灌胶前，加入四甲基乙二胺（TEMED）30μL，10%过硫酸铵（APS）160μl，混匀，立即灌胶。灌胶时玻璃板倾斜15度。胶聚合1小时以上才可以电泳。7 `7 {  g' k3 X2 j5 ~
电泳：电泳仪采用北京市六一仪器厂DYY-10C型。电泳装置使用北京君意东方电泳设备有限司测序装置新JY-CX2B型。电泳缓冲液为1xTBE ，85W预电泳1小时，胶板的温度达到55˚C。点样前，DNA样品95˚C变性5分钟，立即冰浴，加3x loading buffer, 混匀，瞬时离心，点样量16μL，恒功率55W电泳到指定位置，即可卸板染色。

银染操作
电泳结束后，轻轻分离两块玻璃板，将/ s* d4 w# W: L3 x3 P; ?/ A$ {- y
      附着胶的大板置于固定/终止液中，轻摇2 j# B: u2 R( T- p
      20分钟，直至指示染料消失。* Z+ v; B- p' u7 H
凝胶洗涤，回收固定/终止液，用双蒸水( j$ X, x: f+ A% P' K
      洗涤凝胶3次，每次至少2分钟，凝胶板1 ~+ t! k$ a2 ^( ^! ]; a
      从水中取出后，竖起空水15秒。2 R; L$ U" [/ C! _. Q3 V3 i
染色，将胶板移至染色液中，轻摇30分钟。
凝胶显影，将染色后的胶板放入双蒸水中5-10秒，迅速取出并竖起控水，随后把胶板放入预冷的一半显影液中，充分摇动，当出现第一批条带后，倒入另一半显影液，轻摇至条带全部出现。（注意：从放入水中到放入显影液中，时间不应超过10秒。）8 |% ~" x; `3 E
终止显影，在显影液中直接添加等体积的固定/终止液（第一步中用过的），停止显影并固定影像。3 c' [/ k6 j4 L5 x5 c
固定完全后，即醋酸和碳酸钠反应完全(溶液不再有二氧化碳产生)，用双蒸水洗涤凝胶2次，每次至少2分钟，凝胶板从水中取出后，竖起控水凉干备用。                         （第十九天）3 g$ V. H6 s) a9 A

预期实验结果$ K0 B! y4 l( s
同一位置处不同样品电泳条带的不同，显示此处胞嘧啶甲基化状态不同。                                     （第二十天）  ~$ n) x- I& ]) z

注意事项与建议0 I9 K* ~' H7 T* y1 i7 n, c
五氮胞苷（5-azacytidine；MW:244.21）：粉末于-20℃保存，见光或遇热分解，使用时配母液于4℃保存，保存时间不宜超过半个月；
丙烯酰胺为剧毒试剂，配制、使用时必须按有关规程做好个人防护；
思考题
5’-氮胞苷为什么能使DNA甲基化水平降低？' P/ D' d7 l' U* N
MSAP的原理是什么？
如何分析MSAP电泳图？8 @3 i0 H8 g2 z8 }3 S
参考文献 + F. x" ^& |( B5 t1 ?
[1] Razin A, Cedar H. DNA methylation-Biochemistry and Biological Significance. J Chromatogr, 1992, 581(1): 31-40.& I. t# v! Q  R6 w- q
[2] Flavell R B. Inactivation of gene expression in plants as a on sequence of specific sequence duplication. Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 91:3490-3496.
[3] Ng H.H, Bird A. DNA methylation and chromatin modification. Curr Opin Genet Dev, 1999, 9(2): 158－163' \+ L& t& @. o  g/ f
[4] Stokes T. Methylation of a different kind. Trends Plant Sci, 2001, 6(11):503-512.

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