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5’-氮胞苷处理水稻幼苗对基因组DNA甲基化的影响
$ G( E) N& b( l5 k6 S. T+ _庞劲松 刘宝
) f! l U- c |% o j: `* X5 v. C O3 s
( v7 O5 ]1 g% | J+ a4 h* A
文本内容预览：- V, ]: ~4 E. s# {8 z
表观遗传学与DNA甲基化2 g5 x1 Q+ c) w, C& f- P
DNA甲基化作用0 h, E2 E- ]! |2 v: Q# O0 a
DNA的甲基化及其方式" Y& Z) k1 t( `
DNA甲基化的生物学意义
- Z! D- B, G5 I" {, V) k uDNA胞嘧啶甲基化的种类和形成
: U+ h" p- I* ]DNA胞嘧啶甲基化检测
7 v7 f+ K6 `1 d6 R. ]# J% x检测方法：MSAP，bisulfite sequencing
' p: @, L( t( n! s0 K" y2 o5’氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响: e* ?# g# y5 p3 W3 F# K
实验目的0 I+ V: Y9 u( ]+ E" n! u
实验材料# ?1 o! w/ E3 U0 W6 g% c5 ]
仪器
. S0 W6 M# b, O$ r3 j) ]6 z' F) w试剂
' H) B) a+ \3 b. c- n实验方法! V' Z4 q- [6 R% ?) U
5’-氮胞苷处理水稻幼苗
+ a$ V, F0 p; S. q植物基因组DNA的提取与纯化+ d( y) S' [" P$ h8 h, R; b
基因组DNA酶切-连接接头# Z' i8 e9 a! m# U3 B# x
PCR扩增：预扩增，选择性扩增
% S6 l7 |3 Z1 w0 u" h6 Q5 I7 bPAGE电泳1 g( A4 d; I. w+ S+ ~& V! Z7 y. x
预期实验结果
4 i% w2 m, y% k/ g/ m* ]1 T注意事项与建议4 e# x& f: v0 H, f, k
思考题
/ d* J$ p# `* w参考文献
" s; A* B+ E+ n' ?. w' @1 j, @. o. E8 S _/ K- L) f+ B
表观遗传学：
% X* f0 M% X/ I2 q; c+ Z不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变；主要包括DNA的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。/ y$ x) e3 L6 T1 A) ~
表观遗传变异包括: X－染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。
. Q& f( V3 p/ D7 g表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如DNA甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。
1 Y t6 J) J# m4 t( G5 J' @, cDNA甲基化：3 k. r( T _4 ?1 d
在DNA 复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化，将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团连接到DNA 分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程。
$ h) k8 }$ n! ?0 x% e; ~3 d3 f
* f( s; e' I/ e+ c; d9 g DDNA甲基化的方式
2 N/ C0 K9 m0 ~, `/ Q, V2 w5 t胞嘧啶甲基化/ P+ V: U8 @! a1 a% j9 ^9 G! }; x
" Q# m$ V- p( r v
) [7 ^1 e8 [' s
4 b" N: w5 W5 _8 S) h' H0 F' l腺嘌呤甲基化
- F) U5 g; G& d) E, H/ ~3 f' W0 l! p# q
DNA甲基化的生物学意义7 w& `/ H- S7 v! `$ E8 q
影响基因表达状态：通过该表基因调控区DNA甲基化程度调控基因转录4 z3 N, |8 S; v" g% o9 z
# M, y8 m$ y3 _8 U9 o, \& o2 G6 d j7 w! ]1 i( u
图3 甲基化与基因沉默
: W) m& Q) Q4 S; Z. d参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源DNA（如转座子）处于沉默状态+ Q9 g, Q$ U" f! j6 v
提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型. t8 l) G, q0 f- S
1 P6 o3 h* ~+ h3 X4 v& \2 K7 eDNA胞嘧啶甲基化的种类和形成3 L* H/ v) M7 E4 N0 J. q. C
* E4 f: j+ {4 d1 a8 f% k0 ~
从头甲基化 (de novo methylation)
- _2 I/ l0 }8 [8 P5 z: u dDNMT3a，DNMT3b
i1 B& }, A1 k: Z6 ^7 `在完全没有甲基化的DNA上加上甲基。3 U0 x. k9 k1 ` a, u. S) x7 o' \
6 y4 U, d$ o7 @4 o8 A维持甲基化 (maintenance methylation) % M( [/ x: }1 D
Met1，DNMT1
9 L3 F. S1 G7 G+ Z较特异地识别半甲基化状态的DNA，负责
4 ]9 R: ~4 M0 z% D 在细胞分裂过程中依据DNA母链的甲基化
- ~( h& R# t: V- g 状态给新合成的DNA链上加上甲基。
# }/ I S* T6 s8 ?$ D& t
. A. o5 r6 r! c! Z* Q- U DNA胞嘧啶甲基化检测方法3 q7 [! I* j. E) i
8 @* Y, R+ e, c) u5 w8 F1 w使用对胞嘧啶5’-甲基化状态敏感的限制性内切酶进行酶切处理，然后检测多态性：0 J" E0 P# C& t1 ]9 ?# z' { v
甲基化敏感扩增多态性 (MSAP, Methylation Sensitive Amplification Polymorphism)
; e# S3 o1 u& q" a: i D胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序：0 q& ~1 R. \# F; ]. q- j# }& k
重亚硫酸盐测序 (Bisulfite sequencing)
1 G% m8 g) A- L GCmTACT 重亚硫酸钠 GCmTATT# d9 R. m' w; h E0 V
测序 测序
. ?- m" r( ^- u1 q: Q' s! K! R4 Q. d, d此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，CpG岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等 5 ^7 ~. L( z: Z' h
. F; C8 A% N8 k' E4 X: `. C8 N" T
MSAP4 ?1 G4 k) D) G; \8 P7 H
用途：" S! T, G( d0 o6 p8 @) h: m7 b
最常用的大规模检测基因组甲基化变异水平和位点的手段
- u2 z; s2 s y2 z7 _& } K原理：* S0 ~1 j6 b1 U
利用对DNA甲基化敏感性不同的同裂酶分别切割DNA，产生不同的酶切产物，同时将酶切产物添加接头，然后进行PCR扩增、PAGE电泳、银染，产生可见的具有不同酶切型式的谱带，即可得知DNA甲基化信息。7 e8 O3 ~* z; t/ {, d
甲基化状态分析：
2 P. a9 Q, t# m在不同泳道相对应的位置上，如果Msp I酶切产物有扩增带、而Hpa II酶切产物没有扩增带的，说明此处的序列是CCmGG；若都有扩增带，说明此处是CCGG。还可以进一步对差异条带进行切胶回收、克隆、测序，以便得知发生甲基化变化的胞嘧啶的具体位置。! S" y1 g5 z9 {8 ?" H% x' N/ T$ N
( S/ z" q6 |& H A( O
表1 甲基化敏感酶对不同甲基化状态DNA的切割结果
- d/ \& F# `% ~. |/ g+ y" C- n- I8 R
0 u9 E( t4 O( }1 S. A% G6 gMSAP流程：, q: c: ^8 ^. z* K
* c2 e8 }6 {; d
7 c! q- l8 ?; ~( q( d1 u 提取基因组DNA
% K- l, F' `/ w/ ]7 b& ~( H （注意发育时期和成长状态相同）
1 k: p# K9 d* I. @7 j2 s2 c/ v ………ATCCGGTGGCTTGCCmGGAC……
& J& O, G; S2 A- k4 X+ G I ………TAGGCCACCGAACGG CCTG……
2 j6 q8 J2 ~% ]( A Msp I 酶切+接头 Hap II酶切+接头
7 \ P" ^! L* Y4 \ATCC GGTGGCTTGCCm GGAC ATCC GGTGGCTTGCCmGGAC
' r0 L- a$ C! g, CTAGG CCACCGAACGG CCTG TAGG CCACCGAACGG CCTG3 s/ v+ U+ V7 `* H
, P$ ~3 W( C$ U" x7 t7 c# v% a PCR PCR
2 Y+ N' ]$ y5 \% e) k
& V, F0 U" L# v4 p4 Y PAGE电泳 PAGE电泳5 e% i, V1 D. o0 J4 ]
6 Y7 W% s3 t# M
重亚硫酸盐测序
7 |7 p; W; G9 O7 d
! ?5 @6 G5 f ^7 W, s. _* q实验目的# e, b6 m% }5 A; w. h$ q* j+ W
使用不同浓度的5’氮胞苷溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使其基因组DNA胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用MSAP方法检测DNA胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因DNA甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗传表型。6 C1 p. l4 z- w% ], ~0 o2 z; L
* S! _; `# g; R' Y实验材料
$ U+ x. z: U' S5 J" N; f. z水稻：日本晴 (Oryza sativa var japonica, nipponbare)
) U- P/ h: i. _! g
, `0 ~" |: i& K6 p( ]% R 5’氮胞苷如何影响基因组DNA甲基化水平： 5’氮胞苷可以与DNA甲基转移酶（DMT）结合从而抑制其活性，在DNA复制过程中抑制维持甲基化作用，使复制后的DNA甲基化水平降低。# }# E+ P1 B- Q2 Q$ C! l% q
所需仪器
# Y- P, u: u9 }' z7 }- Y离心机 PCR仪 气浴摇床 水浴摇床 植物生长箱
$ V( S% ?1 z) c# e& i+ r9 @0 v! x( A1 o4 x9 m: i
0 @2 _3 c, j) `+ {6 r
, N+ f9 w' a/ D, N: q9 i, M4 z+ L* h% X% r0 y% d
Z, V# z6 N3 i, T
电泳仪 电泳槽 微量移液器 紫外分析仪 分析天平
: T' ]$ L5 C' y. c S3 f9 K0 e
- T4 m# e% a% F$ L+ a试剂" K0 M' f; t: K' @
植物基因组DNA改良CTAB提取液：4 W8 q# r3 r4 m* `$ f4 Q* c
buffer A: 0.35mol/L Sorbitol，0.1mol/L Tris-HCl pH7.5，0.5mmol/L EDTA;
. K* ?: S+ n7 t" Ybuffer B: 0.2mol/L Tris-HCl pH7.5，0.05mol/L EDTA，2mol/L NaCl，2%CTAB;
" X+ [' F; Q1 [& N$ G8 Zbuffer C: 5%N-lauroylsarcosine
' I" g) D1 T3 |1 _PCR试剂：Takara rTaq，10X PCR buffer，ddH2O，
( s; c# b" j$ Y: [/ IPCR引物
: q! {' \7 g" C9 A$ Q; ]预扩增引物：
5 z, m+ d2 Q2 q4 @: G/ G: {5 x H/M+0: (5´-GACTGCGTACCAATTCA-3´)
7 E- d4 P2 @$ H" j" s+ h4 A W2 _ EcoRI+0: (5´-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3´)
+ C' X) |/ a6 [/ e- X( B选择性扩增引物：
3 @# I% |/ @4 V3 x H/M+AN: 5´-GACTGCGTACCAATTCAA(T, C, G)-3´$ X0 w6 u" A9 p" M! c, n
EcoRI+AN: 5´-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T, C, G)-3´。
5 G1 q6 G8 \ U8 c& b9 [酶切-连接试剂：EcoRI (NEB)，Hap II (NEB)，Msp I (NEB)，T4 DNA ligase，T4 10 x reaction buffer# K% u' H* i9 A2 k
接头：EcoRI adapter: 5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’ - p8 R7 `% q7 O% P
CATCTGACGCATGGTTAA
# p: F) t# K2 h0 m5 e HapII/MspI adapter: 5-‘GATCATGAGTCCTGCT-3’; K- ^/ K _2 x. O3 L+ R
AGTACTCAGGACGAGC* H! d5 F6 n) z5 ]9 H) T/ s( z
PAGE试剂：聚丙烯酰胺，尿素，AgNO3，Na2CO3，溴酚蓝， 0 P7 m2 M5 h3 _) N& H
# p0 q: V0 ?% ]! f9 ~
银染固定/终止液 (10%冰乙酸)，染色液 (2升双蒸水预冷，用时加2克硝酸银，3ml 37%甲醛)，显影液 (2升双蒸水中溶解60克碳酸钠，冷却至10-12ºC ，用时，加入3ml 37%甲醛，400ul硫代硫酸钠（10mg/ml）)。
5 s5 T- Y* N2 n( {, C. q: C; b其它试剂：5’-氮胞苷(100mg/mL)，蒸馏水，PVP (20%)，氯仿:异戊醇(24:1)，异丙醇，70%乙醇，RNA酶A (DNase-free)，TE，TAE，琼脂糖，EB，未酶切的λ DNA， 1xTBE (0.089M Tris-borate, 0.089 M Boric Acid, 0.002 M EDTA) ， 3x loading buffer (300 mM NaOH, 97% formamide, 0.2% bromophenol blue)。
7 C3 N4 e. Q; z/ P; R实验方法
5 P, w$ B5 Q% w" @5 \8 z! j5’-氮胞苷处理水稻幼苗：26℃，暗培养 % u6 L9 J$ t9 o, Y
(1) 取水稻Nipponbare种子10粒X 4组，分别置于90mm培养皿内的双层滤纸上，加入15mL蒸馏水浸种24h；（第一天）
3 L! J! p1 D$ e3 j k& J(2) 分为三个实验组和一个对照组，实验组分别用25mg/mL, 50mg/mL, 100mg/mL5’-氮胞苷溶液处理，对照组用蒸馏水培养，共处理10天，每天换处理液1次；（第二~十一天）
% ^. ]0 u' Q- {6 h' f. |& d& C% g7 Y$ d u! B% P
植物基因组DNA的提取与纯化+ ~3 }. x9 s; X; M) e0 c
改良CTAB法(Kidwell and Osborn, 1992)
. m; s) R4 [( q1 k5 ~4 v) U 不同处理的叶片1g6 Z4 P5 x" c; T% K, }3 Q1 {
液氮中研磨成粉
1 \2 F0 C" d8 k' M" l4 Z) M 转入50ml离心管 \6 C8 b: q1 G) [0 f
加入等体积DNA提取缓冲液(A:B:C=1:1:0.4混合，加1%PVP于B液)$ Y$ N2 _; f. r9 B
65℃恒温水浴摇床，40-50rpm振摇90分钟
4 b+ p y$ Q- I# m# B6 V. L+ P 加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒10-15分钟
6 e" Z6 v: x* r3 K/ `- p 4℃3000rpm离心10-15分钟 B2 H1 g4 q& N. k1 C
上层水相
+ W- Z7 R" d& k. H K1 x 加入2/3体积的预冷异丙醇，上下颠倒5分钟并置4℃冰箱内10min
1 A# J' D* l% x7 }. n; G2 W( _ DNA沉淀后于4℃3000rpm离心收集DNA于管底( F$ @9 V7 q, D" W5 N2 m& s
DNA于70%乙醇中过夜。
; D! M! h8 d1 f. Q- w7 O' L DNA沉淀* F4 w q0 e3 W" @1 l' b
（第十二天）
6 _* E1 I3 ~3 F# |, J5 r0 r* V5 ~! x
% |7 _- b, X" v2 j 风干DNA
3 |& A9 B$ k) z; r% {& y$ i Genomic DNA. A% C9 {2 M) e$ J
2ml Eppendorf中加1ml TE溶解沉淀6 P' n4 Z( h, `/ z
待DNA完全溶解后，加入5μl不含DNA酶的RNA酶，37℃保温30 分钟以除去DNA中的RNA。
7 Y" x) Y$ v! F$ P3 P; u0 I 加入等量氯仿:异戊醇(24:1) 纯化DNA，轻轻上下颠倒10-15分钟
* l! c0 E f- w* K( G' D* c1 L 4℃3000rpm离心10-15分钟" E3 Q5 j) P ]/ t4 A
DNA沉淀
& _+ X1 p: {7 @6 @# A 70%乙醇过夜洗涤DNA
j. a) A: p2 E 溶于DNA于200-500μl TE中( a8 U- K, `$ Y. K% O6 }
Genomic DNA溶液
7 O! S0 N8 r2 h E 0.8%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量并据已知的DNA Marker （未酶切的λDNA）估计其浓度。6 Q! Z! X6 S, h# i
调整DNA浓度，置於-20℃备用。 4 m7 ^3 A/ u7 r* Q) I. \
/ T- s$ j4 N" y- m! l6 I
基因组DNA酶切-连接接头
3 `2 n- K# o+ d% X2 W甲基化分析采用两种甲基化敏感酶HapⅡ和MspⅠ（NEB）。在限制性酶切和连接前，先把两个单链的接头复性为双链结构(序列见试剂部分)，即100℃变性5分钟, 缓慢冷却至室温，-20℃冷冻保存备用。5 X- n4 ~( q- c0 q& a i
水稻MSAP限制性酶切和连接体系如下：
6 z/ p8 s8 ]$ z* y$ |- v
5 {0 I3 M0 ^: V6 S. ~PCR扩增
- Q& K2 Y0 O7 M1 r6 Z预扩增：水稻AFLP预扩增体系如右表(预扩增引物PCR引物部分)： , }2 h3 E. Y& ^- ^* H+ t
混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：
/ c) g! w. U6 H6 X- {0 [ `0 k: k4 W& F
; g& L0 E: R; F0 z
7 X) G! G% j/ Q$ w9 m: E' ?1 `$ h" v' l9 E' A
+ `# G$ n7 |$ Z( y% m
1 I0 s( E0 H2 n6 D Q
% A, T8 A. G3 M# x7 L0 R$ w3 ]5 v# g0 c% m, U$ x9 Q- ?4 @% ]1 g
) n' j% X) b- r5 C8 H4 v6 S- I
. z' l1 Z! Q* h \PCR程序：94℃ 预变性2min, 94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸60秒, 共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。0 v% ]; U( N$ ?0 ~. I& [' x+ S
根据检测结果，用0.1x TE buffer稀释预扩增产物1/10~1/40，作为PCR选择性扩增的DNA模板。
8 J+ `4 L, y- W+ \# U7 T+ i$ o$ w2 \7 s2 O
水稻AFLP选择性扩增体系如下： * z" ]0 Y$ x: ~$ y4 B4 S) [( u+ w
, c4 C! A6 o% ]
9 d0 v- {2 L$ Q, l
+ B) \( z+ O/ X B3 k5 b' S1 F) T& D7 J7 X1 T3 L$ N
! ~. o! c( d. [( d- p- u
4 s! b8 c# Q/ t, S+ ?
" F( p2 G' B) o4 ^8 \. O- B! W9 J
按以下参数进行PCR扩增反应： ! }+ V$ i Z$ j! f. T) u: u
94℃ 预变性2分钟, 94℃变性30秒，65℃复性30秒，72℃延伸80秒，以后每轮循环温度递减1℃，扩增10轮。接着94℃变性30秒， 55℃复性30秒， 72℃延伸80秒，共进行40个循环，最后72℃延伸10分钟。 （第十七天）
& T8 h5 p$ \ b- z* V4 B
# s: v$ k ^. E4 V" Q1 `* UPAGE电泳
, v3 o V" ]0 D- i电泳装置图
# f! P4 W, v1 v" Y, T
& o0 o& f+ X1 z/ W- a0 m; C( @1 A5 n: |玻璃板分为大板和小板(上部凹形) 。
/ ?$ U# q" n# t) V% |& u 自来水清洗
9 o/ e. ^' p, m7 u) o' R& I" t# O2 Q; f
95％酒精擦两遍
5 R1 s$ c Y) k2 b; W2 O: h; K0 T# V0 K, R
硅化：均匀擦涂亲和硅化试剂于大板的一面，剥离硅化试剂于小板的一面' \1 ~5 j, y8 g
. j' q/ i% C$ b6 ?4 q0 H 5分钟后，95％酒精再擦两遍，) T6 c# {1 o X7 @; v" _3 G" _9 r
8 E2 a' m4 K$ N% J
装板3 ?" C7 r& _3 B9 `
- h8 t! N/ s6 b# E1 a/ H( u# l 灌胶
% U) P% N& i( U V+ f x6 P/ F& }8 ]* P% m+ B9 } E, P
尿素-PAGE胶配制
6 S: A) `: {1 n( ^8 q$ n+ l! u, w' d7 B1 C$ o
$ L) r2 D- G# \1 h( R
, Y% J& C, `& P8 w4 i& J; ? t8 q4 [* }) f
灌胶前，加入四甲基乙二胺（TEMED）30μL，10%过硫酸铵（APS）160μl，混匀，立即灌胶。灌胶时玻璃板倾斜15度。胶聚合1小时以上才可以电泳。( O, P2 r6 a- s, q
电泳：电泳仪采用北京市六一仪器厂DYY-10C型。电泳装置使用北京君意东方电泳设备有限司测序装置新JY-CX2B型。电泳缓冲液为1xTBE ，85W预电泳1小时，胶板的温度达到55˚C。点样前，DNA样品95˚C变性5分钟，立即冰浴，加3x loading buffer, 混匀，瞬时离心，点样量16μL， 恒功率55W电泳到指定位置，即可卸板染色。
. X: r+ f/ I+ x: l* b0 N
' w, f9 O; W( n7 ~2 A Y5 Z/ H1 v银染操作& C7 j) y7 c9 I
电泳结束后，轻轻分离两块玻璃板，将
7 I; g) m; t7 {: V+ @ 附着胶的大板置于固定/终止液中，轻摇1 {) G- a" @ u1 L3 Q5 j$ y) ]
20分钟，直至指示染料消失。
! L3 o+ X) `' v凝胶洗涤，回收固定/终止液，用双蒸水* s6 Z# R6 i" ~
洗涤凝胶3次，每次至少2分钟，凝胶板, t! M3 L: ]- C7 Q0 G
从水中取出后，竖起空水15秒。" B, Z. {+ ~( A' N! c. I
染色，将胶板移至染色液中，轻摇30分钟。
+ V4 |! F! i9 y! P$ E凝胶显影，将染色后的胶板放入双蒸水中5-10秒，迅速取出并竖起控水，随后把胶板放入预冷的一半显影液中，充分摇动，当出现第一批条带后，倒入另一半显影液，轻摇至条带全部出现。（注意：从放入水中到放入显影液中，时间不应超过10秒。）. n" ^7 w9 P/ w, O+ G6 O. f# v
终止显影，在显影液中直接添加等体积的固定/终止液（第一步中用过的），停止显影并固定影像。3 T# p0 y: O4 l3 k( J [
固定完全后，即醋酸和碳酸钠反应完全(溶液不再有二氧化碳产生)，用双蒸水洗涤凝胶2次，每次至少2分钟，凝胶板从水中取出后，竖起控水凉干备用。 （第十九天）5 P, g( F7 u& M" q) E
6 e3 [6 d* X5 _6 v- U
预期实验结果
$ v$ u# X& [7 {5 K& Y/ C; F0 E同一位置处不同样品电泳条带的不同，显示此处胞嘧啶甲基化状态不同。 （第二十天）" ~5 q* |3 c4 |7 m
" t; _; h2 t8 ?1 w注意事项与建议
, @7 G, K0 y% ?: p9 `- ~7 E五氮胞苷（5-azacytidine；MW:244.21）：粉末于-20℃保存，见光或遇热分解，使用时配母液于4℃保存，保存时间不宜超过半个月；
6 t( W- @7 j2 x, P丙烯酰胺为剧毒试剂，配制、使用时必须按有关规程做好个人防护；
/ j" B( y; e N5 m0 I$ C思考题 h; { @1 U8 Q
5’-氮胞苷为什么能使DNA甲基化水平降低？9 Z. X/ g N$ R6 h; F3 L
MSAP的原理是什么？
! f4 L' G2 j" |/ `* M0 n# O如何分析MSAP电泳图？* `8 V; @1 X) ] N( {: E
参考文献 6 B% W6 y3 {) M% p
[1] Razin A, Cedar H. DNA methylation-Biochemistry and Biological Significance. J Chromatogr, 1992, 581(1): 31-40.
4 e: I/ e+ [% {' p1 o[2] Flavell R B. Inactivation of gene expression in plants as a on sequence of specific sequence duplication. Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 91:3490-3496.
$ c& L4 m: d* k* @[3] Ng H.H, Bird A. DNA methylation and chromatin modification. Curr Opin Genet Dev, 1999, 9(2): 158－163
' x1 V3 a. T! w4 u: _: h# d[4] Stokes T. Methylation of a different kind. Trends Plant Sci, 2001, 6(11):503-512. |
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发表于 2010-9-2 18:23
发表于 2010-9-3 15:59
