Cad-Ⅱ基因转染的兔骨髓间充质干细胞自体移植术后的表达研究△

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作者：向强，邓聪颖，郑文杰，郭国宁，张  远，张  超，周  跃作者单位：1.第三军医大学新桥医院骨科，重庆 ；2.解放军第324医院神经外科，重庆; 3.第三军医大学西南医院急救部
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6 y, g9 i% w! ~8 [& S3 g3 M          【摘要】  ［目的］ 研究Cad-Ⅱ基因转染的骨髓间充质干细胞在骨缺损局部移植后Cad-Ⅱ基因的表达变化。［方法］ 20只日本长耳白兔制作双侧髂骨缺损模型,将体外培养扩增的自体骨髓干细胞经脂质体介导转染Cad-Ⅱ基因，再与胶原海绵复合移植于髂骨缺损处, 术后4周取材, RT- PCR 和免疫组化方法检测Cad-Ⅱ基因的表达。［结果］术后4周各组骨缺损区已有新骨生成，Cad-Ⅱ基因转染移植组和对照组均检测到Cad-ⅡmRNA的表达,但转染组Cad-ⅡmRNA的表达显著高于对照组(P
  Y. D+ }- x' M  H* H  B/ B          【关键词】Cad-Ⅱ；  骨髓间充质干细胞；  骨缺损/ I! |: v0 v, S% C! f$ {
                  Expression of Cad-Ⅱ gene in bone marrow mesenchymal stem cells transfected with Cad-ⅡcDNA after autografted into the bone defects∥XIANG Qiang,DENG Cong-ying,ZHENG Wen-jie,et al.Department of Orthopedic Surgery, Xin Qiao Hospital, the Third Military Medical University , Chongqing ,400037, China
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% h$ H" Q7 F+ q8 h9 yAbstract: ［Objective］To study the expression of Cad-Ⅱ gene in bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs) transfected with Cad-ⅡcDNA after autografted into the bone defects. ［Method］The experimental model of ilium segment defect was established in 20 Japanese white rabbits.The rabbit MSCs were isolated, cultured and expanded in vitro, and then the MSCs, transfected with Cad-Ⅱ and compounded with collagen sponge were autografted into the ilium segment defect. At 4 weeks of operation, the MSCs/ collagen sponge were excised, and the expression of Cad-Ⅱ was evaluated with RT- PCR and immunohistochemical methods.［Result］All of the bone defects treated with implants exhibited new bone formation at 4 weeks postoperatively. In the transfection group, Cad-Ⅱ gene mRNA expression was higher than that in the control group(P
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Keywords：Cad-Ⅱ;bone marrow mesenchymal stem cell;bone defect. @* }1 t, e% ?, J' |5 R
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种子细胞在支架材料上的特异性粘附是其获得良好生物活性的首要条件。为解决细胞在材料上有效粘附难题，通过外源基因的导入和表达, 提高种子细胞粘附、增殖、成骨分化能力的方法，近年逐渐受到关注［1～3］。在前期试验中作者将转染了Cad-Ⅱ cDNA的MSCs在体外与脱钙骨基质复合，促进了种子细胞在支架材料上的粘附。本试验作者对转染了Cad-Ⅱ cDNA的MSCs在动物体内表达的有效性进行了验证。
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1. 1材料含Cad-Ⅱ cDNA 片段的pGCad-1质粒（带有GFP绿色荧光标志）由武汉晶赛生物科技公司合成; Percoll 细胞分离液(天津TBD 公司) , 优等胎牛血清(Hyclone 公司) , DMEM 培养基、地塞米松、β2甘油磷酸钠、维生素C、胰蛋白酶、EDTA (Sigma 公司) , DAB 显色试剂盒(博士德公司)，四甲基偶氮唑蓝MTT、二甲基亚砜(Amresco 公司) , DMEM(Nissui) ; Lipofectin-2000(Sigma)；标准参照物（100 bpDNA ladder）、Taq酶（Promega）；兔抗Cad-Ⅱ-抗（Sigma）、羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记二抗（Santa Cruz）；考马斯亮蓝R-250（Sigma）；醋酸纤维膜（Pharmacia）；化学发光增强试剂盒（Pierce）；成年日本大耳白兔购于第三军医大学实验动物中心。2 [' Y4 p# z5 U
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1.2方法4 _& N9 M! ?0 Q
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1.2.1兔骨髓MSCs的分离、培养取4周龄日本大耳白兔20只做好标记, 用速眠新肌注麻醉。无菌操作下于右胫骨上端内侧部用锐性穿刺锥于骨皮质上开出一直径约2～3 mm的孔，使通达髓腔。用18号硬膜外穿刺针接5 ml注射器，内含3 000 u/ml的肝素0.1 ml，沿骨皮质上的孔穿入髓腔，抽出骨髓血约 2 ml。将收集的骨髓用吸管打匀,加入离心管, 离心5 min, 弃上清。用适量DMEM(含10 %NBS) 打匀,移至培养瓶,置37 ℃、5% CO2培养箱中培养,48 h后首次换液,以后每3 d换一次液,细胞长满后即传代。
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1.2 .2Cad-Ⅱ转染骨髓MSCs转染前1 d用含10 %胎牛血清(fetal calf serum , FCS) 的DMEM调整原代培养的MSCs浓度至3105/ml个，在6孔板中每孔加入细胞悬液1 ml ,37 ℃、5 %CO2 、饱和湿度下培养24 h ,至细胞长成单层,约70%～80%融合;按Lipofectin-2 000 转染说明书将整合有Cad-Ⅱ基因的pGCad-1质粒与其形成转染复合物。将已形成的转染复合物与MSCs混合，吸出转染液,加入含10黃 的DMEM 继续培养。在已建立的培养条件下孵育24 h后，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达, 检测转染效率。% j3 A+ w$ {+ D. I5 [* v- A! P
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1.2.3MSCs胶原海绵复合体的构建及自体移植Cad-Ⅱ转染48 h后, 按1106 将转染MSCs 注入1.5 cm1.5 cm1.5 cm 大小的胶原海绵内设为转染组；未转染MSCs也按1106 将MSCs 注入1.5 cm1.5 cm1.5 cm 大小的胶原海绵内设为对照组, 然后将MSCs/胶原海绵复合物放置于37℃、5%CO2 培养箱中培养4 h。将前面取骨髓进行MSCs分离、培养的20支日本大耳白兔按移植复合物的类型分为Cad-Ⅱ转染移植组和对照移植组，每组10只，速眠新麻醉,无菌操作下显露双侧髂骨，骨刀敲取髂骨制成1 cm1 cm1.5 cm大小的楔形缺损区，分别将MSCs/胶原海绵复合物植入两组缺损区,复位缝合周围肌肉覆盖，术后前3 d给予青霉素肌注， 16万 u/d。4周时将每只动物的移植物取出, 一个放入液氮中冻存, 另一个放入4%多聚甲醛中固定。, b( s2 L. s# v
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1.2.4移植复合体的荧光染色观察取出放入液氮中冻存的移植物作冰冻切片，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。+ [7 L2 X* T" R+ t2 {, g$ V

7 R5 @5 m; G( a( P7 {! H' J1.2.5RT- PCR 检测Cad-ⅡmRNA 的表达将冻存的标本在研钵中研碎, 通过GENBANK检索兔Cad-Ⅱ的cDNA序列，应用引物设计软件Primer 5.0设计引物，由上海生物工程公司合成。（表1）表1Cad-Ⅱ mRNA基因扩增引物序列项目长度(bp)上游引物下游引物Cad-Ⅱ430 5'ACTCCCTCTGTGACAGACGC3'5'GAAGAGTCCAGTTACCCAGG3' β-actin520TACAA CCTCC TTGCA GCTCCGGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC
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提取组织总RNA，合成cDNA，使用PCR扩增仪合成DNA，扩增条件为56C0，35个循环。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。采用Kodar 2.0软件对PCR琼脂糖凝胶电泳进行扫描分析及数据处理。将目的条带的检测值与同一样本的β- actin 条带的检测值相比得到的比值作为目的基因的相对表达量。2 S5 _1 P5 [2 K
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1.2.6Cad-Ⅱ免疫组化染色4%多聚甲醛固定的标本脱钙包埋, 连续切片(片厚5 μm), 按照免疫组化试剂盒说明进行Cad-Ⅱ免疫组化染色, 以细胞胞浆内出现明确棕黄色颗粒为Cad-Ⅱ阳性表达,由彩色摄像机提取图像, 输入Image-pro-plus图像处理系统, 在2020视野下, 随机选择5个视野，以计算阳性细胞占细胞总数的比例和测量阳性区域灰度值的方法判定Cad-Ⅱ表达程度。
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. F9 p* ^' f# l' P+ N1.2.7统计学分析实验数据用SPSS 11.5软件包行双因素方差分析，分别以P* O1 @# \8 {! E% x- W+ z$ B

; I9 [$ P0 M  w" J8 g" n0 F2结果
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2.1相差显微镜观察分离提纯的原代MSCs呈圆形,胞体透亮。5～6 d细胞形成集落状,形态为长梭形及多角形。9～12 d细胞长满单层。经传代的细胞,细胞形态更加单一,4～6 d细胞即可铺满瓶底。（图1）
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! f; z- t7 ?# H4 @0 ~8 R' r2.2pGCad-1转染效率判定MSCs转染后24 h，在荧光显微镜下可见绝大部分细胞内存在明亮的绿色荧光(图2)，提示细胞转染成功。转染率超过80%。- Q. o5 E+ g8 m" x

8 I  i, x& E) d$ D' J; U: b  j5 T2.3移植复合体的荧光显微镜观察荧光显微镜下观察结果显示在术后4周，转染移植组可观察到大量绿色荧光，对照组未见荧光染色(图3)。3 b7 T! }; K2 k4 Q
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2.4RT- PCR 检测Cad-ⅡmRNA 的表达术后4周，两组均在400 bp附近有Cad-ⅡmRNA印迹显示，转染移植组Cad-ⅡmRNA的表达（IOD值为0.3 146±0.0 173），与对照组移植组Cad-ⅡmRNA的表达（IOD值为0.1 472±0.0 151）相比差异显著(P
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. U; q, T8 a: Z0 ~$ j1 M2.5Cad-Ⅱ免疫组化染色Cad-Ⅱ免疫阳性反应呈棕黄色，转染移植组在移植区可见大量的Cad-Ⅱ免疫阳性细胞（AOD值为0.1 018±0.0 215），对照组也可见少量的Cad-Ⅱ免疫阳性细胞（AOD值为0.1 841±0.0 342），差异显著(P* J" f. z7 z% S' j

8 H. f# z+ |1 X# v% M& i+ y; f3 V# d3讨论
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& R) P+ e; E& F6 p5 N3 s$ i种子细胞在支架材料上的特异性粘附是其获得良好生物活性的首要条件［4］。支架材料植入体内后与宿主之间的反应过程可表述为：材料表面/界面对细胞特异性的粘附、分化和增殖效应；生理环境中蛋白的选择性动态竞争吸附；某些吸附蛋白的解吸。由此可以看出，细胞-细胞、细胞-材料间的有效粘附是支架材料能否在体内发挥生物效应的重要保障。为解决细胞在材料上有效粘附难题，通过外源基因的导入和表达, 提高种子细胞粘附、增殖、成骨分化能力的方法，近年逐渐受到关注［2］。图1培养14 d的兔原代骨髓MSCs，细胞基本铺满单层，细胞多呈细的长梭形，呈同心圆放射状分布，有极少数不贴壁细胞(100)图2转染pGCad-1质粒的MSCs（荧光显微镜400）图3Cad-Ⅱ转染移植组术后4周可见大量细胞的绿色荧光蛋白表达图4培养的神经元细胞Cad-ⅡRT-PCR的表达 T:转染组；C:对照组；M:marker(100bp DNA梯度标准)0 U: P- l# a" v
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图5Cad-Ⅱ免疫组化染色图5a转染移植组在移植区可见大量的Cad-Ⅱ免疫阳性细胞图5b对照组有少量的Cad-Ⅱ免疫阳性细胞(200)Cad-Ⅱ属Ⅱ型钙粘附蛋白。新近研究发现其在介导细胞粘附中发挥重要作用，并与胚胎肢节形成和骨组织的形成密切相关［5］。目前已有学者进行了Cad-Ⅱ连接和粘附特性的精确亚结构域结构的研究。Pitter等利用X线衍射晶体分析法确定了Cad-Ⅱ的胞外重复序列1（EC1）编码蛋白决定着粘附的相互作用［6］。也有研究证实成骨细胞分化中存在着Cad-Ⅱ与其他钙粘附蛋白的协同和（或）转换，Cad-Ⅱ介导的细胞-细胞粘附相互作用是除了转录调控外，周围细胞外环境调控的重要形式［7］。作者在前期研究中，利用原核表达体系产生的Cad-Ⅱ蛋白涂布脱细胞骨基质材料，发现可以促进MSCs在材料的粘附，而且经过精确设计、制备的材料表面会对细胞产生特异的选择性吸附作用，同时ALP活性和骨钙素产量检测显示干细胞成骨分化能力增强。作者又进一步通过脂质体介导Cad-Ⅱ cDNA转染体外培养的hMSCs，再与自制的异种冻干脱钙骨基质复合构建组织工程骨，结果发现通过基因转染可提高种子细胞Cad-Ⅱ蛋白的表达，并能促进细胞在支架材料上的粘附，但对细胞增殖无影响。) t8 c) Z* I( y. K  _
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Cad-Ⅱ cDNA转染的M SCs在体外与脱钙骨基质复合促进了种子细胞在支架材料上的粘附。为进一步验证其在生物活体上的有效性，本实验中作者首先采用脂质体作为转染载体, 在体外成功地将Cad-Ⅱ cDNA转入MSCs，并构成MSCs/胶原海绵复合物植入日本长耳白兔髂骨缺损区，4周后，通过RT- PCR 发现转染组和未转染组细胞均能够表达外源性Cad-ⅡmRNA,但转染组表达量显著高于未转染组。同时通过免疫组织化学的方法证实经转染的细胞外源性hTGF- β1 蛋白的表达也显著高于对照组, 从而证实采用此类方法进行Cad-Ⅱ基因转染的种子细胞能在活体动物体内良好的存活和表达，为下一步研究Cad-Ⅱ cDNA转染的M SCs在体内的增殖、成骨分化情况及支架材料的生物性能奠定了基础,也为通过外源基因的导入和表达, 解决种子细胞-材料间的粘附难题作了初步探索。
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