求助：小鼠体外受精

xmliuj

我用的是自己配置的HTF，步骤：取精子获能十分钟后加入htf液滴中，后再取卵丘复合体，卵丘复合体加入已经获能的精子中。可是这样做了几次受精的胚胎细胞很少，基本上都没有受精，请问大家这是怎么回事？到底哪里出错了？我想了几个可能出错的地方，希望大家指点一下：  O' M6 b: @) Y" R% J( p  d
1.精子需要获能1h以上还是获能十分钟就够了？
% O/ X! U! E) H2.受精液滴中先放入精子还是卵丘复合体？如果先放精子那么还需要在受精液滴中再获能吗？如果先放入卵丘复合体，是放入卵丘复合体之后马上加入精子还是要让卵丘复合体在受精液滴中待一会再放入精子呢？+ \2 H) a8 L, o( H1 _
3.HTF自己配置的，因为有几种试剂很少所以称量时是不是很容易不准确？
2 R- |9 P9 k, [4.使用的是sigma的培养皿，组织培养的那种，需要另外买那种IVF专用的培养皿吗？

xmliuj

1、用HTF，精子一般需要获能1h；! @# j- A3 S( F& ]& r
2、先放入卵丘复合体，其实也可以透明质酸酶消化；放入立即放精子就可以
. o% c( B: `: r( p& y ...8 a5 ]0 J- N# f5 @5 V  e
exin11 发表于 2010-9-12 12:18

; V+ i, A# c7 X. P

- {8 t! \8 D7 j/ K# s4 r- a( M" P* w, f
    谢谢exin11的指点，我再做几次试试，如有问题再不吝赐教。

xmliuj

2 v8 T: B; r2 V, q+ K! ?

1、小鼠精子不需要获能处理. ^, \0 X: {5 \: W. x
2、HTF要提前1晚上预温! p7 `  R4 G" g$ m- p5 j5 A
3、先收集COC放入HTF，然后取精子放入受精滴
2 ^3 p0 U0 n& x" I; C3 r4、精子 ...8 x3 T! Y# T/ i! ]3 }5 X. B& t
chiangmax 发表于 2010-9-12 20:51

' Z' v0 M7 a) R0 s  T/ Z# g可是我不知道为什么我的小鼠受精率很低，有时候四十几个卵只有一两个受精的。
- A  _. u8 e, g+ L( k$ c+ U; \1.请问HTF也是自己配制的吗？HTF的PH和渗透压需要检测吗？
# J- H: G( r4 q0 ~$ ]8 U2.提前一晚预温的HFT需要用矿物油覆盖吗？
) H* l% T3 L! c* r+ J3.取精时我只是把附睾尾和下面的输精管剪下，然后用精细镊子撕几个口，让精子在HTF中游出十分钟，这样做有不妥之处吗？( U/ {& K  E$ ]2 g0 @" N2 p
4.大家都说是先放卵子复合体，可是好多文章上都是先放精子，这又是为什么？9 d" N6 @3 b+ M6 a6 r2 a) h# B
5.卵子复合体取出后放入HTF后立即放入精子吗？还是需要让卵子复合体在HTF中预温一下呢？. z- S1 Q: {4 q: K( d) Z
6.精子浓度过低会降低受精率，但是如果精子浓度过高会有影响吗？$ s6 g+ ^( V% \) I8 W1 {6 {
7.取卵的时间是不是很严格的是十二到十四小时？8 N3 t- Y/ w' V5 L; g6 M
8.大家做IVF的受精率大约是多少？  D) X' R, s& W( |
谢谢大家的帮助，在此预祝大家中秋快乐

xmliuj

回复  chiangmax
# ~: }, d$ ~+ f& j: c* X, H) c( F' B5 G5 S2 c* u2 F' ~
$ C) S: r4 K$ e  {) [
    这没有错误，别说那么绝对！！！ 透明质酸酶脱颗粒细胞，消化时间绝对不能过长， ...' a3 d! V- ?, b) |9 `$ _! m7 Y
exin11 发表于 2010-9-12 21:08

( d' _$ _8 [. S0 e- e! W
9 T' i# `& p3 r6 j/ i" \
不错不错，版主啊，这里的学术气氛还是很浓厚的，相信在大家的指导下我肯定会成功的，下面是几个具体问题，麻烦大家帮我出出主意。8 T' d6 |/ J2 q
做了很多次可是我不知道为什么我的小鼠受精率很低，有时候四十几个卵只有一两个受精的。
# h, d% [3 \  ^* D  m& I7 Q1.请问HTF也是自己配制的吗？HTF的PH和渗透压需要检测吗？" N, ]( [- x, Q% R1 b! l8 Q; s( j
2.提前一晚预温的HFT需要用矿物油覆盖吗？
% S1 s! k$ f$ {+ E- S7 W3.取精时我只是把附睾尾和下面的输精管剪下，然后用精细镊子撕几个口，让精子在HTF中游出十分钟，这样做有不妥之处吗？6 u. L6 n  z0 x
4.大家都说是先放卵子复合体，可是好多文章上都是先放精子，这又是为什么？
& }; M: ?+ C: m0 p3 e5 W  ^4 p! N7 n5.卵子复合体取出后放入HTF后立即放入精子吗？还是需要让卵子复合体在HTF中预温一下呢？
6 L7 S9 }- S/ u* v: p6 o( ~' G: }1 w6.精子浓度过低会降低受精率，但是如果精子浓度过高会有影响吗？
3 ?  S2 {3 |/ G- |& r7.取卵的时间是不是很严格的是十二到十四小时？. o0 j/ @, }; [1 \' D
8.大家做IVF的受精率大约是多少？

xmliuj

回复  xmliuj : {. @& x* y/ L
5 \7 R7 O- g" t3 K- N
没太多时间，先简短写下，希望有帮助！: W. u: L1 b/ w7 r3 Z+ A  W' P
1、现在我是买sigma的HTF（主要为了方便），以前 ...
* W2 \5 |" K" rexin11 发表于 2010-9-12 21:45

6 B6 ], `: a  X
+ {9 O+ D( P0 m# e请问取出小鼠的COCs后需要在HTF中培养成熟一个小时吗？精子在HTF中获能一个小时还是十分钟比较好呢？好像资料上都没有写清楚啊

xmliuj

回复  xmliuj 4 o! f& a- C. Y- l* ]$ \

7 Y, M" h1 C% v: k! d2 b" jcocs10分钟，HTF获能1h2 {# n' c1 O) h5 s3 O; S" x
exin11 发表于 2010-9-20 14:34

2 T3 w: s8 w9 J1 M" V6 Y( }# X
+ w+ ?# a) N' p2 I" m; O4 w! O5 }& {+ M1 D8 f. J7 u
我配制的HTF没有加抗生素青霉素和链霉素，这应该不会影响受精率吧？

xmliuj

回复 14# exin11 : S" K. z$ W) D/ N. `5 \  a; c! U

9 N% D) s4 L  F/ q$ c4 G1 d  T$ b. [; r2 n
    请问sigma的HTF货号？我怎么找不到sigma有这个产品。谢谢

xmliuj

回复 2# exin11 % p& x7 U  e! Z- O4 Z# e& D
* f! l& X* U$ z1 U$ _/ Q! J
/ e3 n1 ^5 x9 x1 X0 n- R
    强烈要求建立一个体外受精的QQ群，以便大家交流。各位有何高见？请斑竹决定

xmliuj

回复 26# exin11
9 X6 |9 H, ?  S$ B8 `% f
& x7 J" z0 \8 }, |
6 }3 \' A$ b3 m& g' F/ J  请问您的HTF中BSA的浓度是多少？我的是4g/L，这个浓度适合精子获能和受精吗？

xmliuj

回复 30# chiangmax # M: B% Y. J- w, u5 Z. P3 {
; P. x1 x! ^2 P3 h" m$ R
5 `( M$ I& [. Q/ K' H6 f
    我的是自己配制的。觉得millipore不是很方便，而且那个网站都没有把BSA的含量写清楚。请问BSA的浓度到底是多少才是精子获能和受精的浓度呢？