求助：小鼠体外受精

xmliuj

我用的是自己配置的HTF，步骤：取精子获能十分钟后加入htf液滴中，后再取卵丘复合体，卵丘复合体加入已经获能的精子中。可是这样做了几次受精的胚胎细胞很少，基本上都没有受精，请问大家这是怎么回事？到底哪里出错了？我想了几个可能出错的地方，希望大家指点一下：
3 E, M) L& G  O/ X) a. T6 C1.精子需要获能1h以上还是获能十分钟就够了？# O) e' W+ |# h; O
2.受精液滴中先放入精子还是卵丘复合体？如果先放精子那么还需要在受精液滴中再获能吗？如果先放入卵丘复合体，是放入卵丘复合体之后马上加入精子还是要让卵丘复合体在受精液滴中待一会再放入精子呢？
( R/ e$ T% G9 g5 z- V0 W, u3.HTF自己配置的，因为有几种试剂很少所以称量时是不是很容易不准确？
) O. a$ `; N0 [8 a6 w4.使用的是sigma的培养皿，组织培养的那种，需要另外买那种IVF专用的培养皿吗？

exin11

1、用HTF，精子一般需要获能1h；
% z* i7 n8 }% E; W+ U- p2、先放入卵丘复合体，其实也可以透明质酸酶消化；放入立即放精子就可以
- W) t2 R1 Q3 Q5 }7 c% j3、不会，用万分之一天平，精确到三位，最好第四位上下浮动4就很好了；3 j9 T1 y5 ?# R0 R. F! B& Y
4、可以，不需要重新买
) [7 Y- B2 ?8 |( ]+ a8 m另外，每步换液都要充分洗净！

xmliuj

1、用HTF，精子一般需要获能1h；4 `! u4 M6 ]- A# H$ u* h" E4 A
2、先放入卵丘复合体，其实也可以透明质酸酶消化；放入立即放精子就可以% |# V5 J, T0 }5 \. u
...: x- |# K, _; [8 f2 q
exin11 发表于 2010-9-12 12:18

6 u4 N( a1 {7 A

, B+ \6 o) D/ a% x% B
' F; ]" i1 u9 M' e    谢谢exin11的指点，我再做几次试试，如有问题再不吝赐教。

exin11

回复 3# xmliuj
2 E7 M9 R1 D( @
; ?$ O% j2 ]+ N$ d. Z" z  K3 C2 p$ A! [' E  J
    不客气

chiangmax

1、小鼠精子不需要获能处理
/ j* r. m  }  p" h* Y" V2、HTF要提前1晚上预温) B: f: a) v2 P9 m- o- ^8 X7 ~
3、先收集COC放入HTF，然后取精子放入受精滴. \+ @$ t! \- w: E
4、精子受精密度要适当，过低会降低受精率. [+ t* t4 Q0 L1 O' L, M# m4 N
5、受精时间一般5-6小时，然后换液
7 r5 q: A; ^4 U6 o* z! w2 o6、培养皿不要太苛求，SIGMA的足够

chiangmax

1、用HTF，精子一般需要获能1h；1 c$ h) f; v( S8 \
2、先放入卵丘复合体，其实也可以透明质酸酶消化；放入立即放精子就可以) C! P# E/ W& j  G* s
...
. K- Q) G# A( S* f; }exin11 发表于 2010-9-12 12:18

, ]- Y8 l2 ]# T* E' i
! b1 _& k% F( p
用透明质酸处理这个步骤严重错误，不要误导

xmliuj

) L* O3 N1 f3 R6 i

1、小鼠精子不需要获能处理% {, I1 X- O# W, K* A# n# Z
2、HTF要提前1晚上预温
4 w2 `1 B, v1 }3、先收集COC放入HTF，然后取精子放入受精滴
2 e' U+ X! i4 R$ h8 ^4、精子 ...7 a, ^4 V* C  {) M% t+ k# l
chiangmax 发表于 2010-9-12 20:51

6 @# ?- y2 x5 y9 v1 b2 {
可是我不知道为什么我的小鼠受精率很低，有时候四十几个卵只有一两个受精的。1 o1 P2 ]5 ^7 i* a$ f! {4 R& C
1.请问HTF也是自己配制的吗？HTF的PH和渗透压需要检测吗？+ R* D" o: I2 |# a1 e/ p
2.提前一晚预温的HFT需要用矿物油覆盖吗？
, q! C6 q/ x: X6 b" m/ q' ?; e3.取精时我只是把附睾尾和下面的输精管剪下，然后用精细镊子撕几个口，让精子在HTF中游出十分钟，这样做有不妥之处吗？
1 _" O, s% E1 P+ P' |* J# A9 }4.大家都说是先放卵子复合体，可是好多文章上都是先放精子，这又是为什么？
. q% S( ?3 D9 X; o8 `" b( k3 M5.卵子复合体取出后放入HTF后立即放入精子吗？还是需要让卵子复合体在HTF中预温一下呢？
8 X( L7 v3 i6 T% S6 J6 a2 F6 c6.精子浓度过低会降低受精率，但是如果精子浓度过高会有影响吗？
+ S+ @4 {7 m0 q6 {1 h4 w7.取卵的时间是不是很严格的是十二到十四小时？
  K7 b! C7 P* K- J0 z$ e: c8.大家做IVF的受精率大约是多少？. C3 M9 G+ b# o
谢谢大家的帮助，在此预祝大家中秋快乐

exin11

回复 6# chiangmax , Y% u" H0 o) \% F

, I" p8 l: O, b1 c8 z* K5 l- C/ |
& X+ z  r$ o$ ?; a$ F; T& ~    这没有错误，别说那么绝对！！！ 透明质酸酶脱颗粒细胞，消化时间绝对不能过长，过长对透明带有损伤，必然失败！
% i/ ~4 ?! x5 Z! B我们一直用这一步，个人觉得消化适当有利于精子受精。

exin11

回复 6# chiangmax 2 n( ]: u. P2 X) y

4 b6 T/ L8 f. ^7 l( H" [
. v6 }- b' U; r5 Y, O# l( X  j* i    请不要轻易否定别人的观点，除非有确切的证据来推翻。既然是来求助，那请你虚心一点！！！

xmliuj

回复  chiangmax
" C1 E' n9 f" y# B, d, J& Q7 E+ d3 I/ {+ {4 l- a' b! G& z
# |' I) g* _1 J+ ]6 c# n0 `: E
    这没有错误，别说那么绝对！！！ 透明质酸酶脱颗粒细胞，消化时间绝对不能过长， ...
8 g  G: M1 X; K0 A6 T9 Mexin11 发表于 2010-9-12 21:08

4 F, w$ a0 M4 h& R1 V2 R: |6 j
不错不错，版主啊，这里的学术气氛还是很浓厚的，相信在大家的指导下我肯定会成功的，下面是几个具体问题，麻烦大家帮我出出主意。
2 Q1 m( f% B5 T做了很多次可是我不知道为什么我的小鼠受精率很低，有时候四十几个卵只有一两个受精的。
7 H  m5 [( t+ N: L& D( c  I5 k1.请问HTF也是自己配制的吗？HTF的PH和渗透压需要检测吗？6 d# T$ }1 m( N% w4 T4 d" c6 D
2.提前一晚预温的HFT需要用矿物油覆盖吗？
3 m* _2 b  }; t. Z& o" p- ]3.取精时我只是把附睾尾和下面的输精管剪下，然后用精细镊子撕几个口，让精子在HTF中游出十分钟，这样做有不妥之处吗？
& A. b* e. |0 N& W" ?4.大家都说是先放卵子复合体，可是好多文章上都是先放精子，这又是为什么？9 ~: Z; Q+ t- P2 O7 f' _
5.卵子复合体取出后放入HTF后立即放入精子吗？还是需要让卵子复合体在HTF中预温一下呢？
( r( v* r7 v) B9 \6 M2 U6.精子浓度过低会降低受精率，但是如果精子浓度过高会有影响吗？
6 W& j0 r; U' f/ M9 I$ S" x: v6 `7.取卵的时间是不是很严格的是十二到十四小时？6 Z; e2 P3 i# P
8.大家做IVF的受精率大约是多少？