兔脂肪源性间充质干细胞的扩增及其基本生物学特性

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作者：孙昱  杨海山  王文加  时凤  安东洪  柳林作者单位：吉林大学中日联谊医院放射科，吉林大学药学院 吉林  长春  130033 ) H! o/ D. H6 F+ i1 G" Y7 N; h5 l9 |
                  
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          【摘要】  目的  探讨兔脂肪间充质干细胞在体外的基本生物学特性。方法  选取清洁级新西兰大白兔4只，采用Ⅱ型胶原酶消化兔腹股沟区皮下脂肪组织，贴壁法培养脂肪间充质干细胞。检测细胞生长动力学，测定生长因子EGF对细胞生长的影响，采用免疫细胞荧光法检测基质细胞表面抗原CD44、CD45。结果  所培养细胞由P0传代至P8，每代倍增数目未发现有下降趋势；EGF具有显著的促进ADSCs增殖 的作用，所培养细胞表达CD44抗原，荧光显微镜下呈红色荧光，CD45近似于阴性表达。结论  由兔脂肪组织分离扩增脂肪间充质干细胞，不仅具备干细胞的基本生物学特性，而且增殖稳定，可获得充足的细胞数量，有望成为组织工程的种子细胞来源。
. V* F+ B- g5 e, R          【关键词】兔脂肪间充质干细胞；生物学特性
1 e' i. K* d5 E+ }- V8 T  Y% W                  脂肪间充质干细胞（adipose-derived stromal cells,ADSCs)是脂肪组织中一类多能干细胞，其在体内外特定诱导条件下，可分化形成多种细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、肌肉细胞等〔1～3〕,是目前国内外干细胞研究领域的热点之一。同骨髓间充质干细胞相比，脂肪间充质干细胞的研究尚处在起步阶段。 如果ADSCs预期的胰岛素分泌细胞、血管内皮细胞等分化潜能得以明确证实，其在糖尿病、动脉硬化闭塞症等老年性多发疾病的治疗领域将具有广阔的应用前景。目前对人和大鼠等物种的ADSCs已有多方面研究,但对兔脂肪间充质干细胞(Rabbit adipose-derived stromal cells，rADSCs)的生物学特性少有报道。兔的形体较大,便于进行靶器官定向移植和疗效观测,因而对rADSCs的生物学特性进行深入的研究具有重要意义。本研究采用贴壁法在体外分离、扩增rADSCs,对其形态特征、增殖规律、表面标记等基本生物学特性进行初步研究,为后继的移植研究奠定基础。
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　　1材料与方法# t) W5 i; _( @. J$ a' N* F! k; ~
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　　1.1动物
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1 Y  ]4 K) C' d9 A5 m' s# ^　　4月龄雄性新西兰大白兔4只,体重(1.8±0.2)kg,购自吉林大学实验动物中心。
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9 X/ |+ ]% e2 t) n8 `　　1.2主要试剂10%胎牛血清(杭州四季青)，DMEM (Gibco公司)，Ⅱ型胶原酶、鼠抗兔CD44、CD45单克隆抗体、CY3标记羊抗鼠单克隆抗体(Sigma)。- k% @4 W) p+ k0 n5 o  ?

. S6 P1 F5 G8 o6 y　　1.3方法
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　　1.3.1rADSCs的分离培养
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; D2 ^. L# y& c$ q5 |7 |8 S0 a　　用3%戊巴比妥钠以1 ml/kg体重行耳缘静脉注射麻醉，无菌状态下切取兔腹股沟区皮下脂肪组织，用PBS液反复冲洗，再除去脂肪组织膜和血管，最后剪成1 mm3大小的碎块。用0.075%Ⅱ型胶原酶37℃消化30 min,200目纱网过滤以除去细胞外间质及大块碎片，1 200 r/min离心15 min。用含10%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1105/ml,接种于100 mm2平皿中。
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9 B% C. T, u1 W. e/ b　　1.3.2rADSCs的原代培养
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　　将所分离的细胞置于37℃、5％ CO2、95％空气气相下培养72 h后全量换液,先用PBS轻轻冲洗3次，以去除部分血液细胞和脂滴，置换基础培养液，37℃、5％ CO2、95％空气气相下继续培养。
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" Z/ G6 s* k( |& b5 r& k　　1.3.3rADSCs的传代培养
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9 k9 h# L. `! B　　待细胞生长至占培养皿底壁的80％时传代，先吸弃陈旧培养液，PBS洗2次，用细胞分离液消化至大部分细胞胞质回缩，将要从培养皿底壁脱落时，加入基础培养液终止消化，用吸管轻轻吹打成单细胞悬液，以1：3比例将细胞接种在另一培养皿中继续培养。
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　　1.3.4rADSCs的冻存与复苏- I5 x: ?  u* V& z
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　　冻存：细胞生长至占培养皿底壁80％时，消化并收集细胞悬液，1 000 r/min离心5 min,弃上清液，以5106cells/ml的比例加入预冷冻存液，充分混匀后置入预冷的冻存管中。按4℃条件下30 min,-20℃条件下30 min，-80℃条件下过夜的程序进行冻存，最后置于液氮中保存。复苏：从-150℃超低温冰箱中取出冻存管，迅速投入37℃水浴箱中快速晃动，直至冻存液完全溶解，在1～2 min内完成复温。然后吸出细胞悬液接种在培养皿中，加入基础培养液，于37℃、5％ CO2、95％空气气相下培养。
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　　1.3.5细胞生长动力学检测
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　　细胞生长曲线测定：取生长状况良好的第3、5、8代细胞，37℃下胰酶消化液消化5 min，制成单细胞悬液，调整细胞浓度，按1105/100 mm2密度接种。将接种好的细胞培养皿放入培养箱中培养，每天取出3个细胞培养皿，用胰酶消化液37℃消化5 min，制成单细胞悬液，细胞计数板计算每皿细胞总数。细胞接种当天记为第0天，连续测定8 d，期间未测定皿换液3次。以时间（d）为横坐标，每天测定3个培养皿细胞数的平均值为纵坐标，绘制生长曲线。根据细胞群体倍增时间＝（t-t0)log2 /(logN-logN0)计算细胞群体倍增时间。其中t0:培养起始时间，t:培养终止时间，N0:培养起始细胞数，N：培养终止细胞数。细胞累积生长倍数测定：为了观察细胞增殖能力随传代次数增加有无改变，将细胞传至第8代，每代细胞生长至占培养皿底面的80％时传代计数，细胞生长倍数＝收获细胞数/接种细胞数。
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　　1.3.6生长因子对细胞生长影响测定
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, ?  k; s/ D) h3 F7 a$ X4 T* N　　取对数生长期细胞，制成单细胞悬液，调整细胞为5103cells/ml后接种于24孔板，加入EGF，使其终浓度为20 ng/ml，第3天起每日取3孔计数，取平均值，测定生长因子EGF对细胞生长的影响。
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' U' q6 K3 F9 V$ N　　1.3.7细胞表面标志鉴定) M7 {* M* q  [7 X. \

7 l. o- x( ~; _/ L# q* z3 O( L: r/ M　　P3代细胞生长至占培养皿底壁的80％时，以4％多聚甲醛固定10 min，分别加入鼠抗兔CD44单克隆抗体（1∶400）和鼠抗兔CD45单克隆抗体（1∶400），37℃孵育1 h，PBS冲洗，加入CY3标记羊抗鼠荧光抗体，37℃孵育30 min，PBS冲洗，荧光显微镜下观察、拍照。; o& @4 s& _- o

+ z' e! x- q3 u4 n; V( X　　2结果
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　　2.1rADSCs的分离、扩增及形态学观察+ `& z0 a$ n  I' q' K3 l

" [) e; o- K4 r　　原代培养的细胞24 h内逐渐贴壁，贴壁细胞90％伸展生长，呈长梭形，单核，含1～2个核仁，3～5 d时镜下可见较多的形态均一的细胞组成的细胞集落（图1a）。传代细胞4～6 h即可贴壁，细胞形态与原代相似。P3～P8细胞集落逐渐减少，但细胞生长迅速、增殖明显，镜下可见较多分裂相（图1b）；细胞高密度生长时呈漩涡状或放射状生长排列（图1c）。
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' {0 t# r9 d9 V0 o4 s% q　　2.2细胞表面标志鉴定) ~% }+ v, ~. ^( u6 K
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　　P0至P8的rADSCs均表达CD44抗原，荧光显微镜下呈红色荧光（图2），但P8的表达量有所下降,而P3的CD45近似于阴性表达。
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　　2.3生长动力学检测 8 h6 Q' g2 h1 j* f7 B

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& K( H8 X- m6 |! v( Z$ g　　所培养细胞经过1～2 d的停滞期，进入快速增长期，在第7天达到高峰，与P3、P5相比，P8细胞增殖未见明显减缓，经过8代的传代培养，rADSCs的数量可扩增到原来的5 623.73±118.63倍。细胞由P0传代至P8，每代倍增数目基本保持稳定，未发现有下降趋势。其8代的平均倍增数目为2.15±0.13,说明rADSCs经长期传代，细胞仍能保持良好的增殖能力。
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* a6 M$ o* A% N& N: [- p5 w　　2.4生长因子对细胞生长影响的测定: P3 e8 y6 _$ q4 t3 _' ^
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　　通过P3细胞生长曲线分析，可以确定EGF具有显著促进rADSCs增殖的作用。
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组织工程、干细胞研究已经成为21世纪生物技术研究的焦点，可靠的细胞来源是组织工程研究的基础及首要前提〔4〕。继骨髓间充质干细胞(BMSCs)之后，脂肪间充质干细胞(ADSCs)成为当今干细胞研究领域的又一趋势。由于脂肪组织同骨髓均自中胚层发育而来并同样含有易分离的基质成分，ADSCs与BMSCs有许多相似的生物学性质，它们的细胞标记抗原、生长动力学、细胞衰减、多向分化能力及基因转导能力类似，但ADSCs同MSCs相比,具有来源丰富、取材方便、自体移植无免疫排斥、易于分离培养等优势。因此，一经发现即引起广泛关注，有望成为优秀的自体组织工程种子细胞。
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* i3 x  b% |  ^; {体外增殖能力是评价一种细胞能否作为组织工程细胞来源的一个重要参考指标。通过测定8代内细胞累积倍增数目，我们发现rADSCs在体外可以保持稳定的增殖能力，如果原代收获1106个有核细胞，连续传代至第8代，细胞总数可达5.6109,扩增近5 000倍，数量十分可观。6 u: E9 p# a# L% V  D

1 D- M3 _  ?7 D+ R6 V* X) VEGF可明显促进细胞增殖，在体外的诱导分化过程中，细胞的增殖和分化主要受到细胞所处微环境中细胞因子和/或生长因子的调控〔5〕。EGF具有很强的促分裂作用〔6〕，EGF可活化CD2k(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶），通过CD2k的作用使细胞提前进入S期。此外还证实EGF具有使细胞由静止期进入增殖期，促进cDNA复制，推进细胞周期进程，从而使分裂加快，细胞周期缩短〔7〕。本实验进一步明确了EGF对rADSCs增殖的促进作用。
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6 _6 e5 j: t" z: B现有研究结果尚未发现ADSCs特异性分子标志，只能证明其表达一系列CD抗原。本实验选取CD44、CD45进行鉴定，CD44是基质细胞表面抗原，CD45是造血干细胞表面标志。本实验中分离培养的rADSCs明确表达CD44，证明该类细胞为基质细胞类，并非来自于血液循环中的干细胞。成纤维细胞与rADSCs形态极为相似，细胞表型也很类似。目前还没有可行的方法来区分这两种细胞，因此寻找ADSCs特异性表面标志，纯化ADSCs将是未来研究工作的重点。, S! ]* \/ k* ^) U
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