贴壁培养神经干细胞

深海寂寞鱼

to smkx兄：
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    贴壁培养神经干细胞效果十分不错，细胞的增殖状态要比悬浮的神经球培养好很多；
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/ Y' P3 W3 A& `4 s0 L    而且未分化细胞的比例也高。/ `! G/ ~. C/ `& q* \, X6 S+ I

' R/ o3 v: O! J- D2 p; `% }# p    培养的方法和咱们通常用的方法大同小异。
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    首先注意把培养皿／培养瓶要用Laminine包被好，通常是按1－2ug／cm2，37oC包被过夜。说明书上说的是包被3小时，但是包被过夜效果会很好。
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    ～～～～，不过Laminine可是相当贵的，每用一点点我都心疼不已。' F/ T6 C/ ?' L/ ]/ W- m5 j
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    其次，这个方法最初作者的培养基里N2是自己配制的，提高了N2里每个组分的浓度，他认为这样有利于细胞的贴壁。但是我培养的时候没有按他的方法配制N2，还是用的invitrogen商品化的N2，觉得效果也不错。; w* E) }" N+ }4 r) d

( e3 Y% x) j$ M& i# e    再者，我是用sigma的Accutase消化的组织（37oC，15－20分钟），觉得细胞的活性很好。
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& _  L3 @! {  {" p+ v5 c    最后补充一下，这个方法不是什么新东东，在一些研究神经干细胞的实验室这是一个很成熟的方法。只要认真按照经典文献去做，一定能够成功的。
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    祝好运！！

深海寂寞鱼

回复 5# smkx
& k" A5 c! J3 G. E) R! {2 u" r
4 i' q. R( R: p, y+ Lto smkx兄：
" p0 h) e5 e' v8 o
- y6 `, ]/ y( a4 ^( @    这方面研究中，有三篇文献相对比较经典，分别是：
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1. Conti, L., Pollard, S.M., Gorba, T., Reitano, E., Toselli, M., Biella, G., Sun, Y.,Sanzone, S., Ying, Q.L., Cattaneo, E., et al. (2005). Niche-independent) B/ h8 b8 B+ c6 ^; ]) e/ h
symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e283% u/ G2 j3 E) a# {& j7 |

7 K6 g4 a3 P6 i8 }- L: m3 v2. Pollard, S.M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., and Smith, A. (2006). Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb. Cortex 16(Suppl 1), i112–i120.% v! `& N% x0 N. o( P  d5 u1 \- J: x

' B9 Q& U( ^2 D2 J5 p3. Sun, Y., Pollard, S., Conti, L., Toselli, M., Biella, G., Parkin, G., Willatt, L., Falk, A., Cattaneo, E., and Smith, A. (2008). Long-term tripotent differentiation
0 [# _) E8 o1 P# Ycapacity of human neural stem (NS) cells in adherent culture. Mol. Cell. Neurosci. 38, 245–258.% O8 H5 U, Z. g3 P# n/ c: X0 c* _, X
. e+ I3 S: f" H0 u& ]" U, ^  j" D
全文PDF版如下，希望对你能有所帮助。
5 P$ i5 q- T6 C" q- Q1.
4 V" S- y4 V9 I6 B: o& i! ]) h! F2.
+ p0 `% R$ w( A9 O- \" l3.

深海寂寞鱼

回复 7# leedh1223 4 F- V5 f) z: x# h

- @) G* B5 d& k2 O# D- N0 |to leedh1223:: }2 d5 v+ B3 }, S; X
   
" o& ], q. d3 E6 L  x  |- c1.     用贴壁方法培养神经干细胞既可以直接从原代取材开始，也可以将你已经养成的神经干细胞换用这种方法。如果是后者的话，你只需要将你的神经球消化后直接接种到包被好的培养瓶/培养皿里即可。# b; s) r3 U( J6 c# b
' W8 G0 Q3 l6 o- m0 m' ?/ r; @
2.     贴壁培养下的神经干细胞分化的比例不高，如果需要分化的话，根据你想要分化的方向改变培养基就可以了。具体你可以看看我上传的文献。
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     如果有问题，咱们可以再讨论。

深海寂寞鱼

回复 11# smkx 2 m( w$ ~3 B  H/ C
4 s' _7 I& K5 w- _! M3 W
to smkx兄：
: `7 Q" Z- n2 P" H* u3 f# |
, Q# `) \1 J  b  1.  关于你提到的FBS＋LIF的方法我一点都不了解，所以帮不上什么忙。( P2 x4 A& d) \7 r8 k9 q! n

+ I4 B- x4 z' i2 K8 P5 h% \9 |' ?) ^  2.  关于你问的部分脑组织的问题，在FBS＋LIF条件下会怎样我不太清楚。
& |0 K$ c( {' O! }& v8 D  
/ x+ d8 F$ ^- [- D% G; [       但是在悬浮培养和Laminine包被的贴壁培养条件下，你提到的部分脑组织会慢慢死亡、崩解，随着传代这部分组织在培养物中的比例会越来越少。大致的原因是无血清培养条件下，多数已分化细胞不能存说或者说不能长期存活。
  ^& Y$ S: s9 d. C% k, F4 J1 e
/ Q# n( o8 R6 s* W9 R+ L  不知道我的回答能解决你的疑惑不？  如果有问题我们继续交流。

深海寂寞鱼

回复 18# smkx ) H9 A# \! J, S% T( L& v
3 H5 ?5 h" u6 u) Y- Y; S4 g3 D, L
1 p2 t: G/ t. ~8 C# ]. R7 K4 y
    呵呵，你不就是楼主么？哈哈。。。。。。。。% E0 J3 E0 U2 k6 l9 G# N* y! \) H

- x9 Q* H; n+ _7 J0 ~/ c    不过你提出的这个话题确实十分好。

深海寂寞鱼

回复 15# xfyang2007123 / g# u  Z! f+ i; K. A

# M# X( @* \6 O& Y3 P  L# oto xfyang2007123：
% ]! L3 i+ s8 B% v* o   
/ G+ A$ u7 e1 G; x 1.胰酶、胰酶＋EDTA、胶原酶、Accutase都可以用来消化。: K% \3 H$ R; ^0 D+ I+ u
5 q9 \8 p- N" T: T
    虽然没有做过严格的对比，但是主观上感觉Accutase消化后细胞的活性好像要好一些。如果哪位战友，有相关经验，希望告诉我啊。# c  h% N! S& M6 k  [8 D7 E

3 I" f, o4 C% P, u4 v    在sigma网站查了一下，没有看到Accutase的具体配方, 只是说ACCUTASE is a cell detachment solution of proteolytic and collagenolytic enzymes. Prepared in Dulbecco′s PBS (0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 8 g/L NaCl, and 1.15 g/L Na2HPO4) containing 0.5 mM EDTA•4Na and 3 mg/L Phenol Red。
# c- q# D# n- O+ @    也就是说至少它里面是含有EDTA的。& x! T6 S* O# P0 g- r- U

% J  j. [, ]: e. i5 z7 a+ j& u   这是它的说明书：' T, ?* G. q8 n3 V

3 u) }8 [  I$ `" {2. 在贴壁培养条件下，细胞是可以长期反复传代的。但是长时间的培养，必然会使细胞的特性有所改变。. X2 c- P+ o9 P) q9 s: _
    如果能在10代以内进行自己的实验，结果应该能可靠一些。
* U5 C) Q, p. o  {1 q! D4 [    我在培养过程中发现 随着传代，至少细胞的形态学在发生变化。

深海寂寞鱼

回复 16# jennyshy & P, Z  v- U. p, k
3 c- F6 H3 v- ?/ S: U
to jennyshy：
) l% M' u' C8 L5 X" |& _7 O
# |; {) n6 u! _; Q, `9 |# r8 G    1. 用Poly-lysine包被的培养皿好像是不可以的，还有用gelatin包被的皿也是不行。原因是Laminine提供了类似于体内的微环境，比如类似于SDF或者integrin 6a。具体是在哪篇文献里看到的，暂时找不到了。找到了我会及时上传上来的。9 `: ]  ~9 a9 ~' V- g) O

* p' D, V- `0 Q% [    注：上面的回答是我根据印象回答的，或许会有错误。如果有误，我会及时更正。
* M6 b) {, {0 U
7 z* M! c8 G  w- y    2.我用的方法和文献里是一样的。( Z9 h2 d$ [+ n* F  y
6 N7 h$ ]$ U% s- t- @/ C: U
    3.换液是没有特别注意的地方，和其它贴壁细胞的培养方法一样。当然我发现如果用PBS洗的比较狠的话（比如想去除一些细胞碎片），还是会把一部分细胞洗掉。
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    4.这种贴壁的方法可以使细胞长期传代，而且增殖的速度要比悬浮培养快。0 Q6 O4 u0 k2 E
/ S5 a- \$ D# M4 A  T. O' R# x0 o
    希望你的实验能顺利开展。如果有什么心得或者发现，希望及时给我们讲讲啊。

深海寂寞鱼

回复 17# jennyshy
( b4 _! S* D& e3 M$ u( x" v, n7 I# r
! N3 F$ `7 f3 [0 ^
    关于protocol的问题，我觉得你可以自己从文献里整理。8 D) f+ R& s" @7 X- }0 S4 t

4 y8 H  I, X( D0 \. g. ^9 |    这对于你自己来说也是个思考的过程，有助于更好的理解操作过程还有文献的细节。
! k6 U3 k( t! w2 L( J: W0 \0 ~+ R* ]0 `% X
    我这里有一个相对比较详细的protocol，个人觉得十分的好。不过它是用这个方法来培养肿瘤干细胞的。你可以参考一下。只要把里面的组织材料换一下就可以。希望能对你有所帮助。4 L- J# n2 y' W

3 j; ~  H5 ]' g( \    附件：

深海寂寞鱼

呵呵。。。。。看来大家中秋节都休息了。  S. ^, G! T: h

" v! g3 w/ y: {( B& C我继续和大家分享一些贴壁培养的东东。希望大家一起讨论。7 n5 f' m) Q1 w' H2 C6 x
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这几天我尝试在贴壁培养条件下进行细胞转染。分别使用了invitrogen公司的Lipofectamine 2000和Roche公司的FuGENE HD两种转染试剂。转染条件均是按照各自的说明书操作。转染用了pEGFP-N1质粒。转染后48小时上流式分析。结果是Lipofectamine 2000能有大约10%的转染效率，但是细胞毒性很明显，能看到明显的细胞凋亡/死亡。FuGENE HD大约有4%的转染效率，但是细胞毒性不明显。因为这次没有足够多的细胞数，所以只做了两个试剂的比较。接下来可能会再试试Clontech的Xfect，maybe还得再摸索一下电穿孔的条件。一切还都在准备之中。等有了结果我会拿上来和大家分享。
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7 Y# X5 Z/ @6 B4 z; @" q# a$ I, T需要说明的几点问题：
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1. 大家可能会觉得奇怪为什么我非要用质粒转染而不是考虑用病毒载体。原因是因为我设计的质粒中带有的元件，限制了我绝对不能够使用慢病毒和逆转录病毒。而腺相关病毒没有足够大的容量，也用不成。腺病毒是唯一可能用的，但是也有很多限制，所以一直没有想好是否换到腺病毒中做。  如果大家有什么好的建议，希望大家能告诉我。谢谢了。0 m7 x8 N, w0 O7 j' h- m  o

2 E- s( p( W1 U( Q! e! Q2.  我还曾经尝试在悬浮状态下，对细胞进行转染，结果都是以失败告终。只是在很多次的失败中在荧光显微镜下看见到过一个转染进去的绿色荧光细胞。但是经过转染的细胞几乎都不能再形成球了。) L" y2 X- P, ~. {; V* H
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     以上是我个人的一些愚钝的摸索，或许有些问题在某个文献中已经解决了。但是限于读的文献不多，我还不知道。如果大家有人读到过类似的文献，或者在实验中有这方面的经验，还希望能帮帮我啊。谢谢啦！* f9 G. B- g4 i! v3 o5 V/ c
0 @+ z4 q0 [! a6 r& K4 h1 h4 ]
     也感谢 干细胞之家 能为大家提供一个这么好的交流平台。

深海寂寞鱼

你具体打算诱导出哪种细胞？
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神经元？  星形胶质细胞？  少突胶质细胞？
8 L; [6 k: X0 T
+ W8 {1 m# d) f; G+ A还是说只要分化就可以？ 最好能把三种细胞类型就检测到？, ]7 I6 W3 I; r( f# U; t

; B* O0 X/ p; g! q1 ]7 W你目前用的什么诱导方法？