牵张刺激对大鼠骨髓间充质干细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达的影响 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:26 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：张蕾作者单位：四川大学华西医学中心生物医学工程研究室，四川成都 610041 9 _9 y7 W  N: |0 T# B


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      【摘要】  目的研究机械刺激对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesehchymal stem cells,BMSCs)分化的影响。方法对大鼠BMSCs施以10%形变，1 Hz的周期性单向牵张刺激，并检测牵张不同时段后，其Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA的表达和这2种蛋白的分泌。结果牵张12 h后，BMSCs Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达与对照组相比增高有显著差异，24 h后，种胶原蛋白的合成与对照组相比有统计学差别。结论说明机械刺激可以促进BMSCs合成Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白。
      【关键词】骨髓间充质干细胞胶原蛋白牵张应变! f& g# C! d1 \1 l
   Effects of Uniaxial Stretch on Expressions of Collagens Type Ⅰ and TypeⅢ in Rat Bone Mesenchymal Stem Cells. ZHANG Lei, WANG Xiong, TRAN Nguyen , CHEN Huaiqing.Space Medicine & Medical Engineering,2007,20(5):349～353$ h% p& L( F+ b% n; _: i8 m: `

Abstract:Objective To study the effect of mechanical stimuli on the differentiation of bone marrow mesehchymal stem cells（BMSCs）. Methods A cyclic 10% uniaxial strain at 1 Hz was applied on rat BMSCs for different durations. The mRNA expressions and the proteins of collagens type Ⅰ and type Ⅲ in the BMSCs were measured with real time RTPCR and radioimmunoassay.Results Compared with their corresponding control groups, the mRNA expressions of type Ⅰ and type Ⅲ collagens were enhanced after stretched for 12 h. Whilst, there was a statistic difference in protein synthesis of these two types of collagens after stretched for 24 h.Conclusion The mechanical stretch promotes the protein synthesis of type Ⅰ and type Ⅲ collagens in the rat BMSCs.% z5 F4 e# a# m# H* c2 K! E; |( S0 u

Key words: bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs);collagen;stretch stimuli( b! `  H9 l& f7 l/ T

Address reprint requests to:CHEN Huaiqing.Institute of Biomedical Engineering, West China Medical Center, Sichuan University,Chengdu Sichuan 610041,China

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)来源于中胚层,具有很强的自我复制和多向分化潜能,可产生具有各种表型的子代细胞。在体内、外不同的诱导条件下BMSCs具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力［1 2］。另外，骨髓MSCs获取相对简便，且可从自身获取，对体外培养条件要求不高，分裂增殖能力强，具有在体外诱导分化的潜能，这些特性使骨髓MSCs在疾病治疗中的应用越来越受到关注。因此近些年来，BMSCs的体外诱导定向分化已成为组织工程研究的热点。
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机械刺激是维持组织稳态的重要因素之一，对保持组织功能，尤其是结缔组织功能起着不可替代的作用［3］。但结缔组织并非只是被动地接受各种作用力，而是参与其中，产生动力学响应。在这一过程中，结缔组织的组成成份发生改变，从而改变其力学性能。在细胞水平上，机械信号影响细胞的形态，骨架结构，细胞分化和基因表达。

细胞外基质的合成是细胞的重要特性和功能。韧带成纤维细胞虽没有特异性的标记性蛋白表达，但细胞基质Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达量及其在总蛋白中的百分比是韧带组织和韧带成纤维细胞的重要标志［46］。因此，细胞对Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的合成能力是衡量组织工程化韧带质量的重要标准之一。

本实验采用周期性机械牵张刺激大鼠BMSCs，并检测牵张后其Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达，探寻诱导大鼠BMSCs向韧带成纤维细胞转化的方法，为韧带组织工程构建中种子细胞的选择提供依据。" l. G8 ^/ B# ]6 \& _( J, z2 J

方法
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仪器CO2孵箱(SANYO)，细胞水平牵张仪（自制）；EPTCSXL31240型流式细胞仪（Coulter，美国）；FTCTM2000 system实时定量PCR循环仪（上海枫岭公司）；低温高速离心机（Eppendorf，德国）；水平式电泳仪（BioRad，美国）；680型酶标仪(Biorad)。! O0 I2 C8 k# |- c1 Y# a
8 h9 ]( @2 v# V8 B8 w+ C
细胞培养主要试剂DMEM培养基(Gibco)；胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS, Gibco)；1.073 g/mL淋巴细胞分离心液(北京中山公司)，L谷氨酰胺(Gibco)，明胶(Sigma)。硅胶膜74 mm45 mm0.25 mm（SAGINAW，NAGEL PAPER & BOX CO）。7 o) U0 Q# i% G# @
4 z& ~3 b1 F- g  k* v3 j# e5 b# I' e
主要检测试剂DEPC（Amersco，美国）；TRIZOL试剂（Invitrogen）；逆转录试剂盒（Script TM cDNA synthesis Kit，Biorad）；SYBR Green I 荧光染料(Invitrogen)；细胞总蛋白测定试剂盒（DC protein assay, Biorad）；放免法Ⅰ型胶原检测试剂盒(Orion Diagnostica，芬兰)；放免法Ⅲ型胶原检测试剂盒(Orion Diagnostica，芬兰)；复合蛋白酶抑制剂（Protease inhibitor cocktail tablets，Roche）。9 Q* S/ g5 {( q# i3 E+ y* F" a
7 K. v) N; U) o, N# p: }
BMSCs细胞培养及检测方法参见本实验室前期工作［7］。取第四代BMSCs用流式细胞仪检测细胞表面CD34,CD45和CD99,CD44分子的表达。
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细胞牵张应变的负载取第四代80%融合的BMSCs，用含0.25%胰酶、0.01鞹A(ethylene diamine tetra acetic)的PBS液消化，计数后以3105/膜的密度培养于1%明胶包被的硅胶膜上，24 h后分别负载10%形变, 1 Hz单向水平牵张刺激3、6、12、24、36 h。以未受牵张刺激种植在硅胶膜上的BMSCs作为对照。牵张仪（图1）置于37℃，5%CO2的常规细胞培养环境中。
6 ]5 c$ D8 V0 A/ L0 v+ B
实时定量RTPCR检测BMSCs Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA的表达RNA提取按TRIZOL试剂说明书进行。按常规方法获逆转录cDNA（ⅠscriptTM cDNA synthesis Kit, Biorad）。LightCycler毛细管实时定量PCR仪(Roche, 德国)及SYBR Green Ⅰ PCR 合成试剂盒(Roche, 德国)用于检测Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA 转录的检测。每毛细管反应体系总量为20 μL，含样本2 μL，反映条件见表1。  V$ l" a0 I( a) V+ v/ X* m/ D
) z& i. N! v! ~6 W0 [3 j- X! f6 M
BMSCsⅠ型和Ⅲ型胶原蛋白含量测定分别收集负荷5%，1 Hz牵张刺激3、6、12、24、36 h以及未负荷牵张刺激的BMSCs及其培养液。细胞用PBS浸泡5 min，吸干PBS后,用细胞裂解液（0.5 mmol/L NaCl, 0.1 mmol/L TrisHCl,1%TritonX 100, 1 tablet/50 mL Protease inhibitor cocktail）0.5 mL裂解，收集裂解液至1.5 mL Eppendof离心管，-20℃冻融一次，微量移液器反复吹打，4℃，12 kg离心10 min，提取上清液，表1实时定量荧光PCR引物及反映条件

将细胞裂解液和培养液冻干处理成为干粉状，0.5 mL蒸馏水稀释后，部分用总蛋白浓度测定试剂盒（DC Protein Assay,Biorad）测定总蛋白浓度。其余样本采用竞争放免法，按照试剂盒说明书分别测定PⅠNP和PⅢNP的表达量。测定时，测定管中依次加入PBS 100 μL、标记抗原100 μL、抗体100 μL，充分混匀室温静置20 min，4℃ 3 500 g离心25 min，弃上清，γ计数器测定沉淀物每分钟放射性计数（计数/min，count per minute, c/min）测沉淀物放射性强度。用每个标本双管计数率的平均值在标准曲线上读取浓度值(ng/mL)，经RIA软件处理，得到样本Ⅰ型和Ⅲ型胶原的含量。每微克(μg)总蛋白中胶原蛋白含量(ng)作为样本胶原蛋白的含量。9 `+ I" L4 H* \2 |' M

统计分析所有数据均用x±s表示，在实时定量PCR的结果处理中，采用Oneway ANOVA检测样本与对照组之间的组间差异,以P1 u; [# D) m2 Z$ ?2 F

结果* }( w' o2 _% e5 J

BMSCs细胞培养及鉴定流式细胞仪检测第四代BMSCs细胞表面分子表达情况，细胞CD34,CD45为阴性表达，(94.9±3.2)%的细胞阳性表达CD90,(89.1±2.7)%的细胞CD44为阳性表达，且所得细胞可以被诱导为成骨细胞和成脂细胞（图2）。
2 P' U( e" X" G+ b  v) A' ^
图2第四代大鼠BMSCs表面标记分子的表达(n=6)
3 R  M0 G; ~, D# {
Fig.2Expressions of markers on surface of rat BMSCs of the 4th passage(n=6)
4 {( E3 ?, Q( R
Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达图3所示为PTPCR产物在2%琼脂糖的电泳图片，图3PT-PCR产物在2%琼脂糖的电泳图片
5 N) M. |8 j5 W$ Y* ], T) W) n/ _7 B
Fig. 3Photos of electrophoreses of RT-PCR products in 2% agarose

电泳结果显示所获得的产物分别为Ⅰ型胶原352 bp，Ⅲ型胶原244 bp，与理论值产物片断大小相同。而且，实时定量PCR的溶解曲线光滑平整，只有一个Tm溶解峰，说明产物中无杂物，定量结果可靠。
1 A+ w  B8 I. b7 e
图4所示为实时定量RTPCR检测细胞负载不同牵张刺激前、后mRNA的表达情况。与对照组相比，牵张刺激6 h，细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达量开始增高。牵张刺激12 h，Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达增高与对照组相比有统计学意义。另外，Ⅲ型胶原和Ⅰ型胶原的比例与对照组相比也有显著性增高。3 v& V4 h4 D0 E5 @/ z1 ]9 f

放免法检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原的蛋白表达图5所示为放免法检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原的蛋白表达结果。该结果显示：与对照组相比，牵张刺激12 h，细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达量开始增高。牵张刺激24 h后，这一胶原的蛋白表达增高与对照组相比有统计学意义，而且Ⅲ型胶原和Ⅰ型胶原蛋白的比例由0.40±0.02增加到0.44±0.02, 与对照组相比有统计学意义（图5）。( n& U! q& j1 s3 o5 I

讨论1 d+ }) Z4 l: e' M1 d. O! f: N
" C" h+ ]* U1 w2 i7 d9 U4 Y  e: F
韧带组织是连接在骨与骨之间的致密结缔组织，在维持关节稳定和运动中发挥着重要作用。韧带尤其是膝关节韧带受损后往往难以恢复，常常以瘢痕组织替代。目前常采用自体肌腱替代的手术疗法，但很难使其功能完全恢复，且存在源肌腱的选择、局部医源性损伤、肌腱来源的限制等问题。组织工程为韧带损伤的治疗提供了新的可能图4机械牵张前、后，大鼠BMSCs Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达 (n=7)8 \) p2 i/ A) [& P/ R
4 Y' c) a7 Z# N9 _1 x: T: ~
Fig. 4mRNA expressions of collagens type Ⅲ and type Ⅰ in rat BMSCs before and after mechanical stretch (10%, 1 Hz) (n=7)
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(a)expression of collagen type Ⅰ mRNA of rat BMSCs before and after stretching; (b)expression of collagen type ⅢmRNA of rat BMSCs before and after stretching;(c)ratio of collagens type Ⅲ mRNA to type Ⅰ of rat BMSCs before and after stretching.*P# z1 @/ u4 a: T: d
2 j2 k+ k1 Z1 G, t' [
图5机械牵张前后，大鼠BMSCs Ⅰ型胶原和Ⅲ 型胶原的蛋白表达(n=6); @  k* K, Q: U) S) B9 Y1 H
" F1 f  \; S" i; x8 i
Fig. 5Expression of synthesis of collagens type Ⅰ and Ⅲ in rat BMSCs before and after stretch examined with radioimmunoassay (n=6)

(a)collagen type Ⅰ synthesized by rat BMSCs before and after stretching;(b)collagen type Ⅲ synthesized by rat BMSCs before and after stretching;(c)ratio of collagens Ⅲ and Ⅰ synthesized by rat BMSCs before and after stretching.*P) v( d8 q2 x, C0 S% U6 V
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途径，与以往的修复方式相比具有无异体排斥反应、生物相容性好、可克服器官来源不足问题等多种优点。但体外构建组织工程韧带的研究仍处于初级阶段，支架材料的选择，种子细胞来源，细胞诱导分化以及细胞生长微环境的调节等问题仍有待进一步探索。) }4 `( X7 y# U
* E7 f+ [- _6 _5 i* _
有研究表明，韧带修复部位周围可见新的成纤维样细胞聚集，且这些细胞均由BMSCs分化而来［11］。此发现为组织工程中自体BMSCs替代韧带成纤维细胞的应用提供了理论依据。近10年来，研究者对此进行了大量深入地研究和尝试。Watanabe等［12］将转基因大鼠的BMSCs注射到受损的野生大鼠韧带组织中，28 d后在已经愈合的野生大鼠韧带中检测到存活的转基因细胞，其性状与周围的韧带成纤维细胞相似。Young等［13］用种植了BMSCs的胶原纤维替代兔的跟腱，4、8、12周后检测发现，种植了BMSCs的胶原纤维比未种植组排列更加整齐有序、更具方向性，且新形成的韧带纤维明显比对照组韧带纤维直径粗大。以上实验初步表明，BMSCs在韧带组织修复过程中有可能发挥着作用。目前这些研究仍只局限于BMSCs在受损韧带原位修补中的应用，其在损伤部位被诱导分化的机制尚不明确。韧带组织属于运动组织，可以推测，关节的运动等力学因素对于受损组织的修复肯定起着重要作用［14］。

本实验中所采用的骨髓来源细胞89%以上表面抗原分子的表达为CD90和CD44阳性，CD34和CD45阴性，符合骨髓间充质干细胞的特征［11］，说明所用细胞是骨髓间充质干细胞。1 i9 X6 W. D4 [0 ^. Q

机械刺激可以调节细胞基因表达、细胞排列以及细胞增殖，但其机械信号转导机制及其对细胞命运的影响尚未完全阐明。本实验中，对细胞施以10%，1 Hz的牵张刺激后，细胞排列趋于整齐，且趋向于与牵张力垂直的方向。这与韧带成纤维细胞受单向牵张力后的排列改变一致［1516］。细胞这一改变是细胞在受力环境下，减少细胞变形的反应。细胞的排列趋向于使自身受力最小的方向。有学者就此拟和了公式，并预测了在不同牵张力条件下细胞排列的改变［1718］。本实验结果与他们的理论基本吻合。
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本实验结果观察到受牵张刺激后，BMSCs Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA表达较对照组增高。在12、24、36 h组，Ⅰ胶原的mRNA表达分别是对照组的2.8，3.23，3.23倍，Ⅲ胶原的mRNA表达分别是对照组的3.41，3.98，4.10倍，Ⅲ胶原和Ⅰ胶原的比例在36 h后由对照组的0.44增加到0.56，有统计学意义。
3 }8 _  d, P. I) [2 _  @
同时，放免法检测胶原的蛋白表达也观察到：在牵张24 h和36 h后，Ⅰ型胶原蛋白分别增加到(14.01±1.03)ng/μg总蛋白，(14.21±0.55)ng/μg总蛋白，Ⅲ型胶原蛋白分别增加到(6.07±0.40)ng/μg总蛋白，(6.22±0.40)ng/μg总蛋白，Ⅲ型与Ⅰ型胶原蛋白的比值分别为0.43±0.02，0.46±0.01，比对照组0.40±0.02增高，说明机械牵张刺激有促进细胞分泌胶原蛋白的趋势。Kim等［1516］对韧带成纤维细胞施以10%，0.16 Hz的牵张刺激，24 h后，细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的分泌量分别是静止对照组细胞的1.63倍和2.69倍。说明牵张后Ⅲ型胶原蛋白表达的增高较Ⅰ型胶原蛋白快。Ⅲ型胶原的主要作用是增加组织弹性，相对于其他组织，韧带组织需要更高的弹性和韧性。因此，韧带细胞相对于其他细胞分泌更多的Ⅲ型胶原蛋白，韧带细胞分泌Ⅲ和Ⅰ型胶原蛋白的比例约为0.55，而皮肤成纤维细胞分泌这两种蛋白的比例约为0.25［19］。本实验中，受机械牵张后，Ⅲ型与Ⅰ型胶原蛋白的比值增加到0.43±0.02，0.46±0.01，细胞分泌Ⅲ型胶原蛋白增高的幅度较Ⅰ型胶原蛋白大，说明受牵张后，BMSCs的性质与韧带成纤维细胞更接近了，有潜力作为替代韧带成纤维细胞的理想来源。Ⅲ型胶原蛋白增加组织弹性，这一特点符合韧带功能的需要。8 H1 H3 c# q& y
7 W8 g2 ]( U9 h6 _
但我们也注意到，在未负载机械牵张的BMSCs中，这两种胶原蛋白的比例也高于皮肤成纤维细胞。有研究认为，体内Ⅲ型胶原蛋白多存在于幼稚组织中，BMSCs在功能上更接近于幼稚组织，这可能是该细胞Ⅲ型胶原比例较皮肤成纤维细胞高的原因。
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结论" X, ]# W+ ~8 `# h2 p* f

牵张刺激可以在基因和蛋白水平上影响细胞的蛋白分泌水平，力学刺激在改变细胞形态和排列的同时，可以通过激活细胞内基因的表达来改变蛋白表达，改变细胞的功能。

这一结果为阐述BMSCs在体内分化的机制提供一定的理论依据。也为BMSCs作为韧带组织工程的种子细胞，在体外诱导分化条件的探索提供了一条思路。/ ^6 d; X" I* Y7 S, {. }" ~" M
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