求教：:'( 兔骨髓间充质干细胞培养方法

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最近在养兔的骨髓间充质干细胞，具体方法如下，1%戊巴比妥麻醉后，我们的兔子有约1.75kg，用了大概9ml，不知道怎么回事，然后剪除兔胫骨周围的毛，消毒后切开胫骨中下段皮肤，分离骨膜至胫骨，用钻骨器（16号），从胫骨中下段斜向胫骨平台钻入，然后用10ml注射器针头抽吸骨髓，总共抽吸可能不到1ml，将骨髓放入带有约5mlPBS液的离心管中，离心1000r/min.10min,采用全培养方法，48h第一次换液，发现没有明显的贴壁细胞，4d后第二次换液，也没有明显的贴壁细胞生长，不知道原因出在哪里，请各位大虾指教！

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都没有人给点意见啊，那只有自己顶自己了！

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细胞海洋

等等 不要急 我帮你在群里面转发一下

细胞海洋

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scienese

你的人血清和培养基是什么样的 PH都控制好了？

supergama

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1、实验兔的健康很重要，老兔和病兔的MSC细胞状态相对较差。- c' H! m2 ~! m  T
2、骨髓穿刺没做好，穿刺在骨髓腔应有明显的通透感，且一般穿刺能得到约5ml的骨髓液。
" N; {# i. W5 J# p  [8 F$ F8 {3、我们一般用PBS适当稀释骨髓液后上Ficoll密度梯度离心，取云雾层后培养。+ y4 F5 u/ d1 [2 j. o
4、另外分离取出的细胞可用台盼蓝检活以确定操作手法的正确。
% d: B9 v# c* D2 c1 C3 H5、如果不熟悉骨穿刺，建议采用幼兔，其MSC分离方法类似大鼠MSC的做法。

碧海蓝天

我做过大鼠骨髓间充质干细胞，对比你的实验步骤，可能有以下几个问题：. \! F9 t6 X) |
1、骨髓抽出后置于5ml的PBS液中，PBS配制方案是否正确，为什么不直接用培养基；, [$ y+ Y. w) G5 p& i
2、分离后用台盘蓝染一下，细胞活率有多少；7 A+ q' g- E% M, ]' f
3、48h第一次换液，是否丢了大量细胞，可先试半量换液；
! i/ a5 ^+ i* a4、4d后第二次换液，也没有明显的贴壁细胞生长，再观察几天，有时候细胞生长比较迟钝，多等几天，耐心点；
$ r0 c$ Z% m- v) q( R2 N5、骨髓间充质干细胞来源问题，一般幼鼠比老鼠的干细胞活性好，兔子也是一样的道理。

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非常感谢大家的帮忙，我昨天检查了一下，培养基的颜色有点偏紫，问了一下师兄的意见，说可能是换液的时候暴露在空气中的时间过长，偏碱性了。! w. [1 ]) o2 |
    对了我的培养基是含10%胎牛血清低糖的DMEM液（hyclone），第一次换液后我观察了一下，细胞的数量还比较多，四天以后换液冲洗了一下，结果就没有多少细胞了。& V8 y% G! \1 F" M$ v
    PBS液的配置方案应该是对的，还有我的兔子是3个月大的，没有用培养基的原因是我之前有个同学养大鼠的BMSCs，结果使用培养基冲洗的，效果不好，所以我就改用PBS液了，我没有用台盘蓝染色，回头搜索一下，看是否可以，打算今天再取一次，重新再配培养基，就是不知道第一次换液该选在什么时候了，48h换全液或者半定量，或者干脆多等几天，还请各位指导一下。在此先谢过大家了。

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