养的鼠胚胎干细胞总污染

宇光十色

我养鼠的胚胎干细胞没多久，最近总是出现大肠杆菌的污染，估计是操作过程有问题，特向各位大侠请教！) f  p+ o/ q) @9 V* p
请热心的大侠传授下经验，越详细越好，谢谢！

qianqianlaile

培养基中可以加入双抗，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。链霉素1U=1微克。一般医院的青霉素为80万U/瓶，链霉素为1g/瓶。
% B" }* C& C' L* ?% \一般市售青霉素为80万单位/瓶，将其溶解于4ml三蒸水中；链霉素为1g/瓶，将其溶解于5ml中。
1 G( Y3 w/ F) L# ]可分别取4ml青链霉素配成混和液，这样青链霉素的浓度各为10万单位/ml,然后将8ml溶液稀释十倍，青链霉素的浓度各为1万单位/ml，用时可向培养液中加入1%的双抗，即可达到终浓度为100单位/ml.

qianqianlaile

也有已经添加了双抗的培养基出售，和普通培养基价格一样

supergama

何以见得是大肠杆菌的污染？跑过PCR吗？建议先把抗生素撤了，把污染源找到，一个环节一个环节的找，该扔的扔，该灭菌的灭菌，不行的话实验停下来重新配一套体系。一般mES培养中最容易出问题的是MEF，而最要小心的是支原体等隐性污染。

懵懂干细胞

你好！其实在我们干细胞之家里面已经有很多关于细胞污染方面的帖子了！你可以在搜索栏里面搜索一下参考参考！
0 [" J! {9 h/ s# E$ d
; e) o" i- G3 q& t这里面有一些相关知识希望对你有帮助！

juan880929

Gibco已经有100x浓储的双抗，可以买过来加一下，再有就是看看是不是培养基有问题，总污染同一种菌一般情况下是培养基的问题。再有就是看看是不是本来冻存的ES就有问题。可以用已经配好的培养基养一下成纤维细胞，如果还污染就是培养基问题，如果不污染了就是本来冻存的细胞有问题。

cony

1，培养液配制过程中有无问题？这个很容易解决，开新的就是了。2 S4 X3 ?3 x5 M& k1 @: W
2，接种ES前MEF是否有问题？2 d" S' J4 u$ N- l" J- l% ?
3，操作，器械，
- K6 V! g% e+ k5 |5 [8 n4，实验环境，感觉这个比较重要，前段时间我们也总污染，后来发现是别人在取样时带菌进来了，彻底清洁消毒，: M/ Z/ U4 U; J" f4 R
5，培养箱，至少一个月消毒一次，
) `( w. u6 F4 R5 {个人觉得细菌污染还是比较易控制的，最麻烦的要数支原体和真菌。

宇光十色

回复 2# qianqianlaile % p- o( h" m7 w: c" [! K0 ?* h
$ b0 i4 @2 y3 n

9 [% x) ~* l: S& y9 S+ [    谢谢！培养基中一直都加入了P/S，但还是没有扛住 呵呵

宇光十色

回复 4# supergama
3 t0 S# u1 p1 [5 `
* }# X0 L4 f( r2 i' y3 ?& Q! _. ]$ N恩 在高倍镜下看是杆状小动物在游动，师兄说是大肠杆菌。

宇光十色

回复 5# 懵懂干细胞
9 s1 g% z" D4 u0 ]$ E3 B9 m" K, r" H4 u% E
, P) d! C0 X0 V, l. e
    非常感谢！