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本帖最后由 深海寂寞鱼 于 2010-10-19 13:23 编辑
) j; u I* x V) B$ @, m* |3 n2 v. w
0 I$ ~! o1 j% X- _( a5 i/ a. {to sidalin301：2 a& I2 f8 ]. i9 O6 {
$ z& N9 u9 V0 n. _; f/ I6 u" D- l 你的问题描述的并不是太清楚。大致的意思是把目的基因从pUC57质粒上切下来，插入到pNL质粒中。但是因为没有pNL的质粒图谱，所以你担心可能会把序列反向插入，从而使目的基因不能表达。
, q' q8 m. W0 |1 B Y) ]6 ?" [7 y: `) q |$ p5 i& [
1. 解决这个问题的关键在于找到pNL质粒的图谱，如果没有图谱，一切都是在猜测之中。
D1 F, h/ @" k) I8 ?: r* i2 z
+ z1 m. x) [7 r 我试着帮你找了找，在Addgene的网站一共找到了4个相关的质粒。（见下图）1 t3 l( L; J) x' ~% ]) b$ B
不知道你的质粒具体是其中哪一个？
' z/ P5 T6 K V
F3 v/ P0 T G0 L* t1 Q
! s9 t, T K# C# W 2. 我把这4个质粒的图谱都看了一下，其中并没有你说的同时存在BamH I和Nhe I的情况，倒是有同时存在BamH I 和 Nde I的情况。
- s/ u7 X' A- B, D5 I 希望你再核对一下你的质粒名称，以及酶切位点。' F8 J% T+ b7 V: Q* Z
; O/ Y6 E- V: b, {6 @ 3. 如果你之前提供的信息是对的，那么当你插入你的目的基因后，它一定不会按照你想要的方式表达你的目的基因。目的基因的序列必须和启动子的方向一致，才能得以表达。
) v, G0 P3 V" T. P. O: w6 m/ h% Z7 y& z9 ?7 C; i
如果是这样的话，我能想到的一个简单的解决方法，就是用一平一粘的方法把你的目的基因插入pNL质粒。
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具体的步骤是：
9 ^3 U s4 p/ h7 g: _6 v' Y
5 {# W' F9 [; d/ a7 \7 x# b a.用合适的酶把pUC57质粒和pNL质粒分别线性化； b.用klenow酶把切开的质粒进行平末端化；c. 用BamH I把平末端化好的质粒酶切，产生粘性末端；+ ^! H. F: _$ y n; a
' Y( {' R( r; i
d.然后分别回收你想要的片段进行连接。7 ]6 k8 `1 A' D
" a1 @- |! T# K. }. ^
这样就可以把目的基因正向插入到pNL载体中了。) {( O8 x/ Z$ T( D
% X! O7 ?. ?7 _ 这只是我自己的一点想法，希望别的战友也能一起帮帮忙。 |
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发表于 2010-10-19 10:15
