请教一个双酶切的问题

深海寂寞鱼

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7 P) ^2 P5 V9 I# |to sidalin301：
5 C: c1 G& B& D7 X* J, u
0 P/ q( I" c* F   你的问题描述的并不是太清楚。大致的意思是把目的基因从pUC57质粒上切下来，插入到pNL质粒中。但是因为没有pNL的质粒图谱，所以你担心可能会把序列反向插入，从而使目的基因不能表达。$ _8 P2 Z: y; P7 f6 p) O' E
$ H  ~) m3 P, K5 q6 y- R1 ?* q
  1. 解决这个问题的关键在于找到pNL质粒的图谱，如果没有图谱，一切都是在猜测之中。( k" Z( f$ l1 ~- p% n) J7 _9 W
   
3 `8 z' l# Z0 m) k" k      我试着帮你找了找，在Addgene的网站一共找到了4个相关的质粒。（见下图）. L% k1 E( I9 U0 _
      不知道你的质粒具体是其中哪一个？
. A% S* z' G+ i2 e. {! H      

2010-10-19 13:11 上传

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/ D3 S; W; V0 |+ n# b7 t
  2. 我把这4个质粒的图谱都看了一下，其中并没有你说的同时存在BamH I和Nhe I的情况，倒是有同时存在BamH I 和 Nde I的情况。
; ~% t& }8 z( b* A) J. ?* m* x* u      希望你再核对一下你的质粒名称，以及酶切位点。: ~1 I! |/ k$ {& y0 |& U

) p, F9 p$ q& u2 F) I/ W! Y0 X  3. 如果你之前提供的信息是对的，那么当你插入你的目的基因后，它一定不会按照你想要的方式表达你的目的基因。目的基因的序列必须和启动子的方向一致，才能得以表达。
% g( J. `, a" V& s1 t% {
9 O, j" P9 [0 V, o6 [      如果是这样的话，我能想到的一个简单的解决方法，就是用一平一粘的方法把你的目的基因插入pNL质粒。
/ P% g+ P- P( U! L6 D' @
$ Z4 _/ v3 _1 j4 v  D      具体的步骤是：
9 ^5 X0 g9 \9 b  p0 U5 V+ V
3 V: n8 t8 ]& J) Y3 t' [1 m  j      a.用合适的酶把pUC57质粒和pNL质粒分别线性化； b.用klenow酶把切开的质粒进行平末端化；c. 用BamH I把平末端化好的质粒酶切，产生粘性末端；+ M# T' I' H" {
* ~& B& l& o. ~4 ?. ?
      d.然后分别回收你想要的片段进行连接。; r! w: Z4 \4 K) t$ }

! }( X1 H$ _& b; j$ c     这样就可以把目的基因正向插入到pNL载体中了。
3 k; z4 n; w2 F3 G
& `. |( z! N# g* w3 K9 j6 I4 X' R    这只是我自己的一点想法，希望别的战友也能一起帮帮忙。

djj01

如果有起始密码，反向表达的多肽序列也是无意义的。。。

sidalin301

回复 11# 深海寂寞鱼 & [/ S5 ~7 ]* ^8 r3 ]: k
  u& H" }/ ^1 T! i
6 G/ G8 m$ ]3 C& V! ^
    太感谢你了！想不到你这么热情，我很感动！

sidalin301

回复 11# 深海寂寞鱼 9 `  P% y7 J% \  R

# f; p5 m- r8 G# b3 J
% E& t+ Y  Q9 f; T4 e4 h    能把你的联系方式如QQ告诉我吗？我想以后请教就方便了！

sidalin301

反正就2种结果，方向相反和不相反，我先接上看会不会表达再说，如果不会就是反了，再从新接。
5 F2 y6 M+ W8 B$ D) ^# N谢谢大家的热心帮助！

shiqingxi

选的酶不同应该是不会顺序相反的，质粒构建完成后，需要鉴定，测序什么的应该可以避免你这种问题的。