我是RT-PCR新手 请教一个有关随机引物方面的问题

mckf111

小弟刚进实验室不久 细胞培养的还不错 下一步是进行RT-PCR分析其中一个目的mRNA的表达情况$ w0 l% p' W+ ]+ Y. ^. i4 U
经本人以往了解 做RT的时候所用的引物一般是oligo d(T) 但师兄说这次的mRNA有5kb以上 只能用六聚体随机引物来做反转录 我查阅了一些资料 好像随机引物是以不确定的数目结合到mRNA链（实际上还包括其他RNA链）上的 那么 我的问题是 这样做的话一条mRNA反转录出来的cDNA岂不是有好多条 （每条之间的空隙应该需要DNA ligase来连接 而RT的体系中好像没这种酶。。。） 那我想要完整的cDNA怎么办？？？% `8 A) P' y% D; M' U1 q, j* X. _
还有个问题 如果得到的反转录产物是间断的 那我如何设计后续的PCR引物呢 因为如果两个引物之间不幸含有断点 那岂不是扩不出来了？？？
/ P6 B/ A) H+ Q6 |3 V7 b还望前辈解答！！！

张也行

我记得随机引物的5'端是polyT，和mRNA的3’端的polyA配对，所以随机引物应该只能结合到mRNA的末端吧。
  \" _- \# g6 e/ g$ r4 K我也没做过RT-PCR，不过理论上应该是这样的吧。

mckf111

回复 2# 张也行 # j: ^5 a9 d/ `3 B
既然随机 怎么只能结合到末端呢

djj01

末端应该有特异识别位点吧，且是符合碱基互补配对的！

zhaoyan1983

1.只是看其中一个目的基因的表达情况不一定要将全长P出来，只是P一个片段就可以  h, O1 R! X( Q1 S" I+ s% m
2.如果是想要完整的DNA片段 不妨将几个DNA片段连接在一起0 n2 h  Y% t8 p# `
3. 你的片段太长 RT的话 可能P不出来 到时很难确定到底是没有转录 还是因为片段太长所以没P出来
, [- H( l5 M( ~/ s4.随机引物就是包含了所有碱基组合的引物（如八聚体的随机引物有4的8次方中序列的引物在里面），RNA加热后变成单链的线性状，这时再降低温度退火（0度），引物就跟RNA配对结合了，然后在40多度的环境下由逆转录酶合成与RNA互补的另一条链，这样就得到cDNA了。之后你再以cDNA为模板 以你设计的引物进行PCR 。
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% f! r+ z+ s9 g我感觉应该是这么回事 请大家批评指正！