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作者：王明宁 胡琳 马祁生 侯成荣 杨生玺 张昱 王文青作者单位：（1.青海大学医学院；2.青海高原心脏病研究所 ）
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% b' W( ?4 @1 j: G% @& b) G 【摘要】 目的 探讨刺五加注射液对大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)增殖的影响。方法 体外培养MSC,用四甲基偶氮唑法检测刺五加注射液促进大鼠MSC增殖的作用;用免疫组化法检测MSC细胞的Brdu标记阳性率。结果 4种浓度的药液对MSC的增殖作用与对照组比较有显著性差异（P 1 e; A2 u, ^8 s$ e8 O
【关键词】刺五加注射液 骨髓间充质干细胞 细胞增殖
G; V7 G% I# p' X3 Q C9 B; h5 x6 R EFFECT OF ELEUTHEROSIDE INJECTION8 ~1 v- t6 H& W6 Z0 E
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ON PROLIFERATION OF BONE MARROW" V$ l, v) M6 e1 L& S5 g
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MESENCHYMAL STEM CELLS IN RATS
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Wang Mingning1 ，Hu Lin2，Ma Qisheng1，Hou Chengrong1& x% `5 o' V3 h9 e) v$ E1 V
7 ^1 e+ ~. A! l/ _# TYang Shengxi1，Zhang Yu1，Wang Wenqing1: t1 J7 l/ ?# K8 b: ?7 ?& K' p
+ k) D, D1 A& q, {（1. Qinghai University Medical College；2. Cardiovascular Institute ofQinghai）
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5 S/ K( z& u& Z3 FAbstractObjectiveTo investigate the effect of eleutheroside injection on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs). Methods MSCs were isolated from rat bone and cultured under same conditions. The proliferation effect of eleutheroside injection on MSCs was detected with MTT and the Brdu marking positive rate of MSCs was detected with immunohistochemical method. Results There were significant difference among four kinds concentration of eleutheroside injection on MSC compared with control group (P
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Key wordsEleutheroside injectionMesenchymal stem cellsCell proliferation# o9 D# P5 I) y0 I3 v
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骨髓间充质干细胞( Mesenchymal stem cells,MSC)具有向多种细胞系统分化的潜能，自体获取的骨髓MSC回输后不会发生免疫排斥反应，体外基因转染率高，因此，骨髓MSC已成为组织工程、细胞治疗、基因治疗等方面的研究热点,但骨髓中MSC的含量非常少。我国中药资源丰富，在这些中药中可能有大量的能够促进干细胞增殖、分化的药物。刺五加注射液是临床常用中成药注射剂，能够平补肝肾、益精壮骨,用于肝肾不足所致的短暂性脑缺血发作、脑动脉硬化、脑血栓形成、脑栓塞等症。本研究组通过体外实验研究了刺五加注射液对骨髓间充质干细胞增殖的影响，现报告如下：/ c2 x ]% W% F
& H% \& i& M+ m& _( C7 K1材料与方法
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2 N4 \: |" F6 ^/ d7 U5 E1.1材料
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- ] Z4 J4 X N: R* H淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），L-DMEM（细胞培养液）、小牛血清（Gibcobrl公司），胰蛋白酶（Sigma USA），5 - 溴尿嘧啶核苷(Sigma公司) ，四甲基偶氮唑盐（Sigma公司），二甲基亚砜（Sigma公司），刺五加注射液（黑龙江完达山药业，总黄酮，5mg/ml,批号: 200411231），SD大鼠（青海地方病研究所实验中心）) D0 Q' [+ h/ O& q) x7 |: t
6 _& ] M7 k# g7 s5 I% J1.2方法5 K4 f$ I( b% h7 u/ I
; x( j6 q. `+ k1.2.1大鼠骨髓MSC的分离与培养： 取体重200 g SD大鼠的股骨和胫骨，用DMEM冲出骨中骨髓，将冲出的混合液离心(1. 5 103r·min- 1 )10 min, 去上清液后，用DMEM制成细胞悬液，用吸管沿管壁慢慢将细胞悬液加入已装有4 ml分离液的离心管中，使两种溶液间有明显的界面，水平离心(1.9 103r·min- 1 ) 20 min，用吸管小心吸取中层白色雾状的淋巴细胞层，并用DMEM洗涤2次，最后用含15%小牛血清的DMEM培养液重悬，接种（5107个/ml），置孵箱（37℃，5%CO2）培养，第3天换液，此后每周换液两次。
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; q* @: f2 @8 X% E! l4 a1.2.2加药培养：细胞接近融合时，按1104/ml传代，传至第五代时，将细胞浓度调整为2105/ml，接种到96孔板（100μl/孔）培养24 h后，将上清液吸去，加不含血清的DMEM溶液（100μl/孔），培养24h后，吸去上清液，每孔加100 μl含15%胎牛血清的DMEM培养液，同时加入刺五加注射液（刺五加总黄酮分别为5、1、0.5、0.33、0.25 mg /ml），每个浓度设3个重复孔， 3个阴性对照孔加等量的生理盐水，分别培养24、48 h，用MTT法检测刺五加注射液和生理盐水对细胞的增殖作用。' V$ t: n8 B6 w$ S Y5 j
7 G7 q: d0 u t. o K% x# `& O1.2.3四甲基偶氮唑盐（MTT）的监测：培养24、48 h后，吸去培养液，加MTT溶液（5mg/ml，20 μl/孔）孵育4 h，吸出MTT，加入二甲基亚枫（200 μl/孔），在酶联检测仪490 nm处测试吸光光度值,结果见表1。
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1.2.4细胞爬片的制备：将细胞浓度调整为2105/ml，接种于预先放有涂有多聚赖氨酸玻片的24孔板（1ml/孔），培养24 h后，将上清液吸去，加不含血清的DMEM溶液（1ml/孔），继续培养24 h后，吸去上清液，每孔加0.59 ml含15%小牛血清的DMEM培养液及5 - 溴尿嘧啶核苷（Brdu），同时加入刺五加注射液（浓度梯度为：原液，5倍、10倍、15倍、20倍稀释液）0.41 ml/孔，对照组加生理盐水（0.41ml/孔），一个浓度设3个重复孔，使每孔Brdu的终浓度为10 μg/ml。' Z d% [4 B1 Z& k
2 [ R+ L( H* H+ }5 }1.2.5Brdu的检测：培养48 h后，吸去培养液，用 Carnoy液固定细胞10 h，自然干燥。3%H2O2、室温条件下孵育5～10 min(以消除内源性过氧化物酶的活性)。蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5min。5%～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10 min， 倾去血清，滴加适当稀释的Brdu抗体（1：200），37℃孵育2 h, PBS冲洗(5min3times)。滴加生物素化山羊抗大鼠IgG， 37℃孵育20 min。PBS冲洗（5 min3times）。DAB显色5 min，封片。每张切片镜下随机选取10个视野计数阳性细胞数，取平均值，结果见表2。 表1刺五加注射液对MSCs增殖的影响 注：实验组与对照组的比较： *P
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* k' N! ^1 a6 ^' h1.3统计学分析 a( \/ x! R4 g& r
c* U. ]$ n# u5 h' T本实验所有计量资料以均数±标准差表示，显著性检验采用方差分析，组间比较采用几个处理组均数与一个对照组均数比较的Dunnett法。
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2结果
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2.1MTT法监测刺五加注射液对MSCs增殖的影响： 表1显示，刺五加组的吸光度与生理盐水组比较有显著性差异。24 h OD值：实验2至5组分别与对照组比较，P值均小于0. 05，而实验1组与对照组比较，P>0. 05 ；48 h OD值：实验2至5组分别与对照组比较，P值均小于0.01，而实验1组与对照组比较，P>0. 05；而且不同药物浓度组间的吸光度也存在一定差异,实验1、5组24 hOD值比较，P
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2.2刺五加注射液对MSC Brdu标记阳性细胞数的影响4 F( |4 {$ B6 |/ j! J
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表2显示，刺五加组的阳性细胞数与生理盐水组阳性细胞数比较有显著性差异，实验2至5组分别与对照组比较，P值均小于0. 05，而实验1组与对照组比较，P>0. 05。 表2刺五加注射液对MSC Brdu标记阳性细胞数的影响注：实验组与对照组的比较： ﹡P p- V! N6 I/ l9 c9 l% c$ x" X
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3讨论' I8 r1 R; u$ W; K* Y8 e
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干细胞治疗是通过动员或移植自体、异体干细胞进入宿主体内,以补充、替代或纠正某些组织细胞数量或质量异常的细胞,造血干细胞移植治疗白血病和其他恶性肿瘤已取得了良好疗效［1］。刺五加注射液为五加科植物刺五加的茎叶经水醇法提取精制而成的棕红色灭菌溶液,为榛皮酊、丁香苷和金丝苷等皂苷、多糖和黄酮的混合物［2］。刺五加皂甙(ASS) 能提高神经元存活率、降低LDH 释放量及NO 含量［1］ 。刺五加尚含有超氧化物歧化酶,具有抗氧化作用［3］。刺五加可增加冠状动脉回流量、减少心肌氧量,清除自由基对组织的损害等作用［4，5］。 本研究用5个不同浓度的刺五加注射液培养大鼠骨髓间充质干细胞，作用24 h、48 h后通过MTT法观察，显示其中4个浓度的药液对MSC具均有增殖效应，且作用48 h后4个浓度的药液对MSC的增殖作用更为显著；应用Brdu标记MSC后同样也观察到其中4个浓度的药液组的MSC的阳性细胞数与生理盐水组阳性细胞数比较有显著性差异，说明刺五加注射液对MSC的增殖具有一定的促进作用。刺五加注射液促进MSC增殖的作用原理可能和其抗氧化作用有关，具体作用机制还需进一步确认。3 T9 j3 |; {* A
【参考文献】
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发表于 2009-3-3 12:27
发表于 2015-6-23 07:08
