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作者：赵亮，魏旭峰，孙阳，陈瑜，易定华作者单位：第四军医大学西京医院：心血管外科，消化内科，陕西 西安 710033
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【摘要】 目的： 采用蛋白质组学方法研究人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)和成纤维细胞中的蛋白表达差异. 方法： 对hBMSCs和成纤维细胞的蛋白样本进行双向凝胶电泳分离，通过比较两种细胞的蛋白组学图谱，确定差异表达的蛋白点；而后对差异点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析和蛋白数据库信息检索；最后选取其中的5种蛋白进行Western Blot实验验证蛋白质组学的研究结果. 结果： 在hBMSCs和成纤维细胞中鉴定出29种差异表达蛋白，其中有17种蛋白在两种细胞中有显著差别地表达，另外12种蛋白在两种细胞中有相同丰度地表达. Western Blot的实验结果进一步验证了蛋白质组学分析的结果. 结论： hBMSCs与成纤维细胞中蛋白的差异表达体现了两种细胞在细胞形态、结构和功能上的异同性，这对于研究hBMSCs向成纤维细胞分化以及应用hBMSCs构建组织工程瓣膜具有重要意义.
1 q y3 r; M6 t+ |& J 【关键词】骨髓间充质干细胞 成纤维细胞 蛋白质组学/ l! B# [9 j9 p- F0 y9 a
Proteomics analysis between bone marrow mesenchymal stem cells and fibroblasts' l$ B4 X' n q7 K# H. d' r( O7 H
# s3 c" g: k) \' N" V* n ZHAO Liang,WEI Xu-Feng,SUN Yang,CHEN Yu，YI Ding-Hua% t4 G5 |7 ]* }. Q5 _# x' N
0 [( A2 y3 C- e4 A* C3 W c Department of Cardiovascular Surgery,Department of Digestive Diseases,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xian 710033,China
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1 D6 m; p' o, A# y 【Abstract】 AIM: To find out the differences and similarities on the protein expressions between human bone marrow mesenchymal stem cells(hBMSCs) and human fibroblasts,which have different cell characteristics and similar cell morphology. METHODS: The protein extracts were obtained from hBMSCs and fibroblasts,and separated by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE). And then the differential protein spots were identified by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). The results from simultaneous proteomic profiling were further validated by Western Blot of selected proteins. RESULTS: Twenty-nine differential proteins were successfully identified in hBMSCs and fibroblasts. Among them,17 proteins were expressed significantly differently in hBMSCs from that in fibroblasts,and another 12 proteins equally expressed in the 2 types of cells. CONCLUSION: The differential protein expressions between hBMSCs and fibroblasts provide a new insight into the differential cell structures and functions between the 2 types of cells,which might be valuable for further study of fibroblasts differentiation from hBMSCs and the application of hBMSCs for creating tissue engineered heart valves in the future.4 W7 Y/ {+ q: L) Z" m2 N, _
8 T- J- _3 V- Q9 \ `2 r 【Keywords】 bone marrow mesenchymal stem cells； fibroblasts； proteomics* B6 _- v$ S. K, w% E9 k+ N
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0引言0 ?2 a- V i) F9 B+ J; |
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骨髓间充质干细胞（BMSCs）是目前理想的组织工程瓣膜间质细胞的种子细胞；相对于血管来源的种子细胞,MSCs具有获取方便、多向分化潜能，以及独特的免疫特性，能够在同种异体微环境中组织中产生免疫耐受的优点［1-2］. 该研究拟全面比较hBMSCs和成纤维细胞中蛋白表达的差异，进一步在蛋白水平理解两种在细胞结构和功能差异. 这对今后研究hBMSCs在体外向成纤维细胞的分化诱导，以及应用hBMSCs构建组织工程瓣膜是非常必要的.
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4 |/ L* c4 m" K! k: z, G; I 1材料和方法
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+ Y5 B8 I k# G1 b$ \# x 1.1材料人骨髓来源于本院骨髓穿刺室，经过骨髓细胞学检查排除了血液系统的恶性疾病. 人成纤维细胞（HDF）是购自Cell Applications公司（www.cellapplications.com/index.htm）. 细胞分离、培养的主要试剂：Percoll淋巴细胞分离液(密度为1.073 g/mL)，DMEM/F12（低糖），磷酸盐缓冲液(PBS)，硫酸链霉素、青霉素（均自Gibco，USA），胎牛血清，CD34，CD44，CD29和CD105抗体（Sigma，USA）. 双向凝胶电泳的主要试剂：尿素、硫脲和甘油（均自Sigma，USA）,CHAPS (美国Merck),两性电解液、IPG预制胶条(pH 3～10，130 mm)和碘乙酰胺（均自Bio－Rad，USA）,Bradford蛋白质检测试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司). Western Blot实验所用抗体（Sigma，USA）.
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# b, h7 d; T+ z& s4 {$ f: @$ ^+ }9 G 1.2方法(1)细胞培养和hBMSCs的鉴定:骨髓经肝素钠生理盐水(1200 U/ mL) 肝素化后，PBS液洗涤、离心,弃掉骨髓中的脂滴等杂质，而后采用Percall淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，获得的单核细胞静置培养于DMEM/ F12培养液（含100 mL/L的胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺(Bio-Whittaker)和50 U/mL青霉素,50 mg/mL庆大霉素. 原代细胞在2～3 d可见少量贴壁细胞,细胞形态多样、不均一；继续培养，细胞多呈梭形,漩涡样或放射状平行排列，形成较多的细胞集落. 10～14 d后细胞即达80%～90%融合；传代后细胞集落消失,细胞均匀分布,平行排列,较紧密,3～4 d即可传1代. 当hBMSCs扩增至第3代时，采用流式细胞术分析hBMSCs的表面分子. 细胞不表达造血标志CD34,CD45,而强表达CD29,CD105，阳性率分别为99.4%和99.5%［3-4］. 同时，在培养的第3代细胞体系中加入成骨细胞和脂肪细胞诱导剂,可成功地诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化［5］. 这表明分离培养的细胞为具有多向分化能力的hBMSCs. 成纤维细胞在上述细胞培养液中进行常规培养和扩增.（2）hBMSCs和成纤维细胞的双向凝胶电泳（2-DE）：将hBMSCs和成纤维细胞细胞分别悬于裂解液(8 mol/L尿素,40 mL/L的CHAPS,40 mmol/L Tris，适量PMSF)中,混匀后用液氮反复冻融,再加入适量RNA酶和DNA酶,冰浴20 min. 4℃离心(14 000 g,30 min)，收集上清液. 用Bradford法测定蛋白含量,其余蛋白样品在-80℃中保存. 双向凝胶电泳（2－DE）分离细胞蛋白提取物,第一向固相PH梯度等电聚焦(IEF)：取适量蛋白样品与水化上样缓冲液(8 mol/L尿素 40 g/L的CHAPS 20 mmol/L DTT 5 μL /L IPG缓冲液 痕量溴酚蓝)混合,银染检测时蛋白质的上样量为100～200 μg,考染检测时的上样量为800～1 500 μg,上样总体积350 μL. 按程序等电聚焦结束后,将胶条在平衡液Ⅰ(6 mol/L 尿素 375 mmol/L Tris 20 g/L的甘油 20 g/L的SDS 20 g/L的DTT)中平衡10 min,清洗后再置入平衡液Ⅱ(6 mol/L 尿素 375 mmol/ L Tris 200 g/L的甘油 20 g/L的SDS 100 mmol/L碘乙酰胺)中平衡10 min. 第二向垂直平板电泳（SDS2PAGE）：将胶条移至130 mL/L的丙烯酰胺胶上分离. 参照文献［6］的方法对凝胶进行银染并扫描成像. （3）图像分析：凝胶用AGFA DuoScan T1200凝胶图像扫描仪扫描,比较分析hBMSCs和成纤维细胞全蛋白凝胶数字化图像，比对分析采用Imaging Master 2D Elite 5.0软件完成. 确定有显著性差别的蛋白表达丰度比值标准为 n＞2或n＜0.5.（4）质谱分析及数据库检索：对选取的蛋白点进行胶内酶切,提取多肽混合物，纯化后，取1 μL溶液和等体积饱和基质溶液混合,加至不锈钢靶上,室温干燥,采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱分析法（MALDI-TOF-MS）检测蛋白多肽. 通过两种检索引擎Aldente (http://cn.expasy.org/tools/aldente/)或 Profound software在两种不同的蛋白数据库(NCB Inr和Swiss－Prot)进行数据检索. 数据库的搜索选择下列参数:固定修饰为碘乙酰化(半胱氨酸),裂解酶为胰蛋白酶,允许未酶切位点的最大数为1,转换最高值为0.2,最大坡值为200,内部最大误差值为50,最少匹配肽段数为4,P＜0.05. 把匹配得分超过显著性阈值的作为蛋白质鉴定的基础. （5）蛋白质印迹分析：为验证hBMSCs和成纤维细胞蛋白质组学研究的可靠性，从中选取5种差异表达的蛋白：α-smooth muscle actin（α-SMA）,enolase 1,vimentin,60 S acidic ribosomal protein P0 and cofilin-1,进行蛋白质印迹(Western Blot)分析. 各取两种细胞进行蛋白质组学分析的蛋白样品于100℃变性5 min. 在具有10道双垂直电泳槽内每孔内加入60 μg蛋白质，120 ml/LSDS-PAGE电泳，转膜，50 ml/L脱脂牛奶封闭2 h，杂交一抗，4℃过夜. PBST洗膜3次，每次10 min. 杂交二抗，室温摇床上1 h，PBST洗膜3次，每次10 min，DAB 试剂盒显色. 运用BandScan V5.0 软件对免疫反应条带进行定量分析.
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9 P3 J2 D$ ~9 } 统计学处理：资料用SPSS V10.0 数据处理软件包进行统计学处理. 计量资料以x±s表示，P
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- L" R3 o- A7 v7 X$ u6 P- M. l 2结果
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2.1hBMSCs和成纤维细胞蛋白的差异表达hBMSCs和成纤维细胞全蛋白提取后,进行双向凝胶电泳分析,共进行3次实验得到银染结果，两张电泳图谱的蛋白斑点分布模式有相似性（图1）.
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1～17： 两种细胞中不同表达丰度的蛋白;18～29： 两种细胞有相同表达丰度的蛋白.
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# \$ O) E* a9 j, c 图1hBMSCs(A)和人成纤维细胞(B)的双向凝胶电泳图（略）
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: h8 ?+ k9 f9 U5 E 3次重复实验结果经ImagingMaster 2D Elite 510软件分析,发现hBMSCs可以检测到782±65个点,成纤维细胞可以检测到760±57个点,这些蛋白质等电点和相对分子质量分布范围较广,但大多数集中于pH 4～8,相对分子质量15～100 ku区域. 对其中29个稳定表达的差异蛋白质斑点进行切割,用胰蛋白酶消化后进行MALDI-TOF-MS分析，通过UniProtKB/Swiss-PROT和NCBI nonredundant protein databases蛋白数据库搜索，成功地鉴定出29种差异表达的蛋白，其中1～17种蛋白为两种细胞中有显著差别表达的蛋白点，18～29种蛋白为两种细胞中有相同丰度表达的蛋白点（表1）.# X+ J; C A7 c3 u
# X9 Z0 s1 A0 A6 M4 f8 T 表1hBMSCs和成纤维细胞中表达的29种蛋白（略）& S. Z7 E; @% J: @2 |! ]
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a：9.1，b：2.0，c：2.2（在hMBSCs中表达高出倍数）； d：10.5（在成纤维细胞中的表达高于的倍数）. @, q. Z) T8 a+ \& r3 B
; t `5 X& o' f2 t/ d 2.2Western Blot结果为验证双向电泳分析的准确性，选取其中的5种蛋白：α-平滑肌肌动蛋白,enolase 1,vimentin,60S acidic ribosomal protein P0 and cofilin-1作进一步的蛋白质印迹分析，5种蛋白表达量比较与双向凝胶电泳蛋白表达丰度的比较结果一致（图2）.5 ?. _. w7 Y4 A- F
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图2hBMSCs和人成纤维细胞中5种蛋白的Western Blot结果（略）
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hBMSCs是目前理想的组织工程瓣膜的间质种子细胞，成纤维细胞较肌成纤维细胞对于维持正常心脏瓣膜的结构和功能具有更重要的意义［7-10］. 但尚不清楚hBMSCs向成纤维细胞进行分化的机制，应用hBMSCs构建的组织工程瓣膜均需移植入动物体内后一段时间才能完成组织工程瓣膜的成纤维细胞表型和基质的最后重塑. 但是，有研究表明组织工程产品在体内复杂的生物环境中重塑会存在个体差异性［11］，可能会导致组织工程瓣膜不能被很好的重塑而导致再次衰败. 因此，通过比较hBMSCs和成纤维细胞中的蛋白表达差异，从细胞的蛋白水平理解两种细胞的结构和功能上的差异，对于研究在体外诱导hBMSCs向成纤维细胞分化，以及应用hBMSCs构建TEHV是非常必要的. 2 X# |: M# S/ p5 X2 w
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/ Y& U6 N/ M% U/ H hBMSCs最初被定义为骨髓中在体外能够粘附生长、增殖和具有自我更新和多向分化能力的“成纤维细胞”样细胞［5］，它们在形态上和成纤维细胞非常的相似. 免疫细胞化学分析显示hBMSCs具有肌成纤维细胞样的表型特点［7-8］. 通过流式细胞分析技术研究，一系列的表面分子在hBMSCs中被发现［3-4］，然而，有研究发现那些细胞表面分子在成纤维细胞表面有同样的表达. 此后，进一步通过基因组学的方法研究发现，在两种细胞中确实存在一些差异基因.
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+ U2 r3 n) ~5 [+ _6 M: q" J! v" D 蛋白质组，作为细胞基因组的最后表达，能够更详尽、更直接地描述细胞的结构和功能特点［12］. 我们第一次采用比较蛋白质组学的方法研究了hBMSCs和人成纤维细胞的蛋白表达差异. 采用2-DE分离细胞蛋白样本，银染凝胶，而后挖取蛋白点进行质谱分析仍是目前有效的蛋白质组学研究方法. 在这项研究中，通过比较hBMSCs和成纤维细胞蛋白的2-DE图谱，对其中29个稳定表达的差异蛋白质斑点进行了质谱分析、鉴定，相应蛋白数据库信息检索和功能分析. 在hBMSCs和成细胞中具有等量高丰度的表达. 这种蛋白在两种细胞中的相同表达显示了两种细胞在形态和组织来源上相似性. 为了验证蛋白组结果的可靠性，我们进行鉴定、分析的29种差异蛋白中，选出5种蛋白进行了Western Blot实验. 两种实验得出了相同的结果，进一步证实采用蛋白质组学方法在蛋白水平研究细胞的形态、结构和功能的可靠性［13］.
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实验通过分析hBMSCs和成纤维细胞中的蛋白差异表达清楚看到了两种细胞性质不同的hBMSCs和成纤维细胞在形态、结构和功能上异同性. 这些结果对于我们今后研究hBMSCs向成纤维细胞分化和应用hBMSCs构建TEHV是非常有意义的.3 c" ]/ C2 k/ N2 m3 J! s: Y
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发表于 2009-3-3 12:27
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