人脂肪干细胞分离培养鉴定及向成骨细胞诱导分化的实验研究 - 脂肪干细胞专区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:28 |显示全部帖子 |倒序浏览 |打印

作者：王栋作者单位：东南大学医学院附属徐州医院骨科，江苏徐州  221009



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      【摘要】  目的  探讨在成骨诱导条件下人脂肪干细胞（adipose derived stem cells，ASCs）的体外诱导分化情况。方法  脂肪组织来自整形外科吸脂者，以Ⅰ型胶原酶消化抽吸物分离其中脂肪细胞，体外培养并测定第一、二、三代细胞增殖速率，绘制细胞生长曲线，计算群体倍增时间。流式细胞仪检测抗原CD105、CD106、CD166、CD29、CD49d、CD34、 CD31，分析酶消化法获得的细胞分别向成骨、成脂定向诱导，明确其分化能力。结果  第一、二、三代细胞生长稳定，群体倍增时间约60h。流式细胞仪检测显示，干细胞相关抗原CD105、CD106、CD166、CD29表达率均>60%，但与造血系统相关抗原CD34和与内皮细胞相关抗原CD31的表达率分别为7.1%和28.7%。向成骨细胞诱导可见矿化结节形成，免疫荧光检测显示骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein， BSP)、骨桥蛋白 (osteopontin， OPN)、骨连接蛋白(osteonectin， ON)表达；向成脂肪细胞诱导可见脂滴形成。结论  脂肪干细胞体外增殖能力强，来源充足，细胞获得量大，可能成为骨组织工程的种子细胞的来源。
      【关键词】脂肪干细胞成骨分化骨组织工程
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近年来，骨组织工程取得了辉煌的成就，但是种子细胞一直是制约其发展的瓶颈。骨髓基质干细胞的应用因其一次取材获取的细胞数量少，对供体创伤大等缺陷而受到限制。自Zuk 等［1］发现脂肪基质干细胞以来，脂肪干细胞（adipase derived stem cells,ASCs）因其取材方便，一次取材获取的细胞数量大，对供体创伤小等优点成为种子细胞的研究热点。本实验在国外研究的基础上，通过研究人脂肪干细胞的分离、培养、鉴定及向成骨诱导分化过程，探讨脂肪干细胞作为骨组织工程种子细胞的可行性，并为脂肪基质干细胞在骨组织缺损治疗中的价值提供直接证据。, Y  p$ h* {6 @, e! I

1材料与方法' `( B2 r+ b+ K+ k. _" e( L

1.1实验试剂与仪器9 h) v0 f- M9 D% s# A' I
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Ⅰ型胶原酶(美国Worthington公司)，DMEM粉剂（GIBCO公司），胎牛血清（FBS,HYCLONE公司），转铁蛋白、异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)、吲哚美辛（Indomethacin）、VitD3、油红染料均购自Sigma公司，鼠抗人OCN、ON、BSP单克隆抗体及羊抗鼠IgGHRP均购自美国DAKO公司。2 _5 @* T% ]: N. i$ X0 O0 D, N2 l
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主要实验仪器包括恒温恒湿培养箱（Forma公司，德国），倒置相差显微镜（Olympus公司，日本），精密天平（Mettler Toledo公司，瑞典），细胞计数仪（Beckman公司，美国），激光共聚焦显微镜（LSN510，Zeiss公司，德国），流式细胞仪（Beckman Coulter公司，美国），自动计数仪（Beckman Coulter公司，美国），恒温摇床（太仓美华生化仪器厂），超净工作台（上海医疗器械公司），100mm培养皿、50ml离心管（Falcon公司，美国）。2 s3 q, c/ a& u- U! B# n

1.2脂肪组织来源" T" D: w, ]- @! k. D: `

本实验所用脂肪组织来自东南大学医学院附属徐州医院整形外科吸脂者，均为女性，年龄20～45岁，抽吸部位为腹部，方式为电动负压吸引。
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1.3ASCs原代培养

无菌条件下取脂肪组织，0.075%Ⅰ型胶原蛋白酶消化（放入37℃震颤水浴槽中60min），1 200g离心10min，去除漂浮的脂肪细胞及上清液，DMEM培养液（含10％胎牛血清，100μg·ml-1青霉素，100μg·ml-1链霉素）重悬细胞，接种至培养皿中，以3104个有核细胞·cm－2密度接种，在37℃、CO2体积分数为5％、湿度为100％的培养箱中孵育，48h后首次换液，弃去未贴壁细胞。细胞生长至75％～90％汇合时传代，每2～3d更换培养液。5 W/ y7 w0 G" W7 f  D  N) v

1.4生长曲线的测定' s" G5 r$ W' V& o+ s6 q

分别测定第一、二、三代ASCs进行增殖速率。取对数生长期细胞，消化并计数，调整细胞浓度为1104ml-1，细胞悬液接种到24孔板中，每孔1ml，分为10组，每组3空，共30孔。采用细胞计数仪计数，细胞直径区间参数设定为5.0～16.6μm，直径16.5μm的细胞忽略不计，每天计数1组，3孔取平均值，共10d。绘制生长曲线，计算群体倍增时间。

1.5流式细胞仪检测相关抗原" G& B8 ]* Y* ~" V
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用流式细胞仪对原代ASCs表面特异性抗原进行检测。0.25%胰蛋白酶＋0.02鞹A消化待检细胞，1 200 r·min-1离心5min，弃上清，调整细胞浓度为1.5～3.0106ml-1，吸取1ml细胞悬液加入Ependorf管中，加入各类待测一抗，4℃孵育30min，加入荧光标记的二抗，4℃孵育30min，最后用10%福尔马林固定细胞，用流式细胞仪测定各类抗原的阳性率。

1.6向脂肪细胞诱导

取第二代ASCs，DMEM培养液培养3d，加入成脂肪细胞诱导液。诱导液成分为DMEM基础培养液和0.5mmol·L-1 IBMX、1μmol·L-1地塞米松、10μmol·L-1胰岛素、200μmol·L-1吲哚美辛。向脂肪细胞诱导14d，倒置相差显微镜观察细胞形态变化。. M" i1 H+ g  z' j
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油红O染色：成脂肪细胞诱导14d的脂肪干细胞用10%多聚甲醛在4℃条件下固定1h，70%异丙醇清洗，加2%油红室温下5～10min,异丙醇洗去多余的染料，PBS冲洗，倒置相差显微镜下观察细胞内脂滴形成。! t0 N; L/ r! E+ v) z1 Q, J9 Z

1.7向成骨细胞诱导

第二代ASCs用成骨诱导液诱导，诱导成分为DMEM基础培养液、10nmol·L-1 VitD3、37.5mg·L-1 VitC和2.16g·L-1 β磷酸甘油（ascorbate2phosphate）。成骨诱导14d，倒置相差显微镜下观察并进行检测。

碱性磷酸酶染色：成骨诱导7d的ASCs用0.4%多聚甲醛在37℃条件下固定15min，PBS冲洗，pH 9.8 TrisHCL 缓冲液37℃浸泡20min，加入BM Purple 37℃孵育30min，0.5mol·L-1 NaOH 终止液终止反应，倒置相差显微镜下观察。2 F  M3 N% u; A- Y, F9 a, [

Von kossa染色：成骨诱导14d的ASCs，蒸馏水冲洗，75%酒精固定20～30min，加入5%硝酸银紫外灯下过夜，蒸馏水冲洗后加入5%硫代硫酸钠，2min后镜下观察。5 ]& W% `9 H! H% w7 C) b2 `
5 d+ J) d( y& A
茜素红染色：成骨诱导14d的ASCs，蒸馏水冲洗，75%酒精固定20～30min，蒸馏水冲洗后加入2%茜素红10～20min，镜下观察。
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免疫荧光检测：成骨诱导14d的ASCs，细胞爬片，丙酮固定5min，加入OCN、ON、BSP一抗，4℃过夜，加入FITC标记的二抗，37℃孵育1h，PBS冲洗，Propidium Iodide核衬染，激光共聚焦显微镜下观察。
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2结果
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2.1原代ASCs形态学观察
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初分离的细胞形态呈小圆形，直径5μm，色深，接种4h开始贴壁，24～48h细胞处于生长停滞期，48h细胞完全贴壁，开始伸展，多数呈成纤维细胞样梭形，有的呈三角形，细胞直径增加到20μm左右，呈集落样生长（图1）。
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A. 培养3d40；B. 培养5d40；C. 培养7d40  G0 W6 v0 |; o
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图1原代ASCs形态学观察1 _& N% o+ ~/ h# s; v

2.2体外生长观察
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分别绘制第一、二、三代细胞生长曲线，结果显示第一、二、三代细胞1～3d均出现生长停滞期，4～5d进入快速生长期，8d后进入平台期。群体倍增时间约为60h（图2）。* A# o3 x$ u- w" _

图2第一、二、三代ASCs生长曲线2.3原代细胞表面标记的鉴定

流式细胞仪检测显示，与干细胞相关的抗原CD105、CD106、CD166、CD29等表达率均大于60%;CD 49d表达率高达88.2%,与造血系统相关的抗原CD 34表达率为7.1%,与内皮细胞相关的抗原CD31表达率为28.7%。说明获得的原代细胞是由未分化的基质干细胞、内皮细胞、造血系细胞等组成的混合细胞群。! G7 b# q4 J5 h5 _7 V/ y

2.4向脂肪细胞诱导
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倒置相差显微镜观察可见，经成脂肪细胞诱导后细胞增殖速度明显降低，细胞形态发生明显变化，由长梭形变为椭圆形、三角形，诱导4～5d后细胞内出现圆形脂滴，以后脂滴逐渐增多增大，诱导14d，大多数细胞内充满了脂滴。经油红O染色证实为脂滴（图3）。
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A.成脂诱导14d脂肪脂滴形成200;B.油红O染色脂滴呈红色2002 E& V2 O. G1 l2 r% y! T

图3ASCs成脂肪能力检测. c( t- ?, a, B, e

2.5向成骨细胞诱导# C9 V; x  w  _

倒置相差显微镜观察，经成骨诱导3～4d细胞形态由长梭形变为扁圆形，细胞核变圆，细胞体积增大，长轴缩短，胞膜有多个伪足伸展，细胞外基质有少量钙盐沉积，有些形成钙结节，随着诱导时间的延长，钙盐沉积增加。成骨诱导7d，经碱性磷酸酶染色（AKP染色）提示细胞内有大量酶颗粒形成，与成骨细胞活性相关的碱性磷酸酶表达阳性(图4A)。成骨诱导14d，茜素红染色、Vonkossa染色图片中提示细胞外基质大量钙盐沉积（图4B,C），ON、OCN、BSP免疫荧光图片中均见相关蛋白阳性表达（图5）。2 i) T& h: _4 U6 T5 F6 _
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A.成骨诱导7dAKP染色200;B.成骨诱导14dVonkossa染色40;C.成骨诱导14d茜素红染色40+ {5 ~2 D8 [9 ^9 w0 C

图4ASCs成骨能力检测
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A. ON表达阳性B. OPN表达阳性C. BSP表达阳性0 u, U8 C- T. `& x. m
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核为Propidium Iodide染色，呈现红色，蛋白呈现绿色

图5免疫荧光检测蛋白表达2 U$ L, g" \+ n# y4 y) j

3讨论

骨组织工程的种子细胞要满足下列条件：(1)易于分离培养，扩增较快；(2)有成骨潜能；(3)取材方便，对机体创伤小；(4)稳定性好，连续传代后仍能保持成骨潜能。自2001年Zuk等［1］报道ASCs具有多向分化潜能以来，ASCs已经成为骨种子细胞研究的热点。人体内脂肪组织丰富，来源充足，每300ml脂肪组织可以获得2～6108个有核细胞［12］。体外连续传代15代，细胞仍具有稳定的增殖能力和较低的老化水平［1］。- K, ]) V, |! p1 w+ T( g

本实验结果显示证实，第一、二、三代细胞生长曲线稳定，细胞群体倍增时间约60h；流式细胞仪检测到原代细胞中除有与干细胞相关的抗原CD105、CD106、CD166表达，还有与造血系统、内皮系统抗原的表达。说明我们获得的细胞并不完全是干细胞，还混杂了内皮细胞、造血细胞等，但干细胞抗原表达率>60%。目前还无法获得纯化的脂肪干细胞。
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Zuk等［3］分别采用含地塞米松和无地塞米松的成骨诱导液进行成骨诱导，结果发现，无地塞米松成骨诱导液组钙盐沉积明显优于含地塞米松成骨诱导液组。本实验采用无地塞米松成骨诱导液，成骨诱导7d碱性磷酸酶染色阳性，14d细胞外基质有大量钙盐沉积，茜素红、Vonkossa染色有钙结节形成，免疫荧光检测提示细胞有成骨相关的蛋白ON、OPN、BSP的表达，证实了ASCs具有成骨能力。成骨过程大致可分为3个阶段［4］：首先是细胞增殖和基质分泌期，其次是细胞外基质成熟期，最后是细胞外基质矿化期。VitC参与早期Ⅰ型胶原的形成，β磷酸甘油被细胞分泌的碱性磷酸酶水解释放出磷酸根离子参与基质的矿化，最终在VitD3、VitC、β磷酸甘油三者的联合干预下，成骨过程基本完成。

本实验除进行成骨细胞诱导外，还对ASCs进行了成脂细胞诱导。诱导14d油红O染色结果表明ASCs可以向脂肪细胞分化，虽然不能排除脂肪前体细胞向脂肪细胞分化，但文献报道脂肪前体细胞只占到脂肪组织有核细胞的2％，显然如此多的细胞向脂肪细胞分化不能只用脂肪前体细胞来解释。  {- |# b+ H  L. p, @5 E0 _
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本实验研究表明，ASCs来源方便、可靠，细胞获得数量充足，是骨组织工程中优良的种子细胞来源。但通过目前方法获得的细胞是多类细胞的混合群体，混杂了内皮细胞、成纤维细胞等，可能会对ASCs成骨诱导分化产生不利的影响，这对组织工程骨的构建是不利的，因此，如何获得纯化的ASCs是组织工程面临的一个关键问题。# ]2 M: Z3 a0 _5 X, U
      【参考文献】: r6 y0 {7 U, |5 p6 f0 N
［1］Zuk P A,Zhu M,Mizuno H,et al.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cellbased therapies［J］.Tissue Eng,2001,7(2):211228.

［2］de Ugarte D A,Ashjian P H,Elbarbarty A,et al.Future of fat as raw material for tissue regeneration［J］.Ann Plast Surg,2003,50(2):21521.
8 J0 n9 M4 C8 w0 Z3 G
$ P. p. U# Z6 z; H7 A4 }: e

［3］Zuk P A, Zhu M,Ashjian  P,et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells［J］.Mol  Biol  Cell,2002,13:42794295.0 g7 @" n7 E9 _0 E) ]

4 ~+ |4 J- K$ U" G
, w" N  t6 ^: q. S4 V3 Y/ r8 B: K
［4］Owen T A,Aronow M A,Shalhoub V,et al.Progressive development of the rat osteoblast phenotype in vitro:reciprocal relationships in the expression of genes associated with osteoblast proliferation and differention daring formation of the bone extracellular matrix［J］.Cell Physiol,1990,143(3):420430.

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