慢病毒转染的疑惑？

cc1986

刚开始做，有个问题想弄明白6 c1 m' L: }6 S+ u( J% y5 ~
我的慢病毒载体上有耐药基因 ，绿色荧光蛋白基因，和目的基因。。慢病毒载体转导到目的细胞里面后有很高的几率整合到目的细胞的基因组里，问题是：
0 m4 x/ {9 T- s0 S6 u1 y9 r. \' l1 在转导成功后，是不是细胞质和细胞核同时慢病毒载体，而且细胞质和细胞核会同时表达耐药蛋白和绿色荧 光蛋白及目的蛋白？
4 ~3 C. |) f/ E$ s- l5 s2 是否整合进去就意味着这三个基因一定会表达
; l! x* s2 Z; z9 _/ O3 还有，三个基因是连在一起整合，还是三个随机组合整合的？6 u4 F1 A% k6 w+ n0 m
求解释，谢谢大家~

ellapan

这个可谓大神帖！

amanda

非常感谢分享

绿雪

回复 11# cc1986
9 H8 G- F$ B5 x4 m" w6 d8 K0 ~% h0 P2 u4 E$ m, g- D
% E- x7 F/ |, K/ h2 l" Y
    一般情况下是随机整合的，用打靶载体的话可以实现定点整合。整合拷贝数也是各不相同的。整合位点和拷贝数都可以通过实验方法得到检测。

cc1986

回复 10# 绿雪 $ z- R0 N$ d* J! b5 J+ }& u$ O
' N: ~( u+ `' a9 @* ]/ H: p5 F
非常感谢，学习到了~~继续请问一个很傻得问题，一般说我们转染的目的基因整合到目的细胞的基因组里面，是怎么定位的啊？是固定整合到某一特定的位置，还是很多位置都有整合？

绿雪

' W2 n! ~/ S" \4 X. h/ J+ @/ G0 ~# d: L; {# z; ?
回复 8# cc1986
  W. G1 ~, O: Q: O* t* v, O' D. A. ?

3 b# e$ r4 y& n+ `: w$ y0 A    我并不明白楼主的协同表达究竟是指什么？我是做多基因共表达的，据我的了解，多基因共表达的方式有很多，多质粒共转染，一质粒多启动子，一质粒一启动子，其中一质粒一启动子的构建方法又有很多。而所谓的协同表达是我们的目的，可以通过融合表达来实现，也可以通过非融合的方式实现，所以，在我的理解，协同表达和融合表达并不是两个平行的概念。值得一提的是，融合表达的蛋白也可以得到各自分离的蛋白，不一定都是连接在一起的，这只需要在构建融合表达载体的时候加一些特殊序列就可以了。这也是蛋白翻译后加工的一种方式，在这种方式作用下，融合表达的蛋白切割后各个单体蛋白相互独立，生物学功能不会相互影响。

深海寂寞鱼

to cc1986:
, i) [$ w8 _  i$ h- ?) V( d& N& f8 V
   协同表达  指通过IRES将目的蛋白的基因和EGFP基因 连在一起，构成双顺反子。8 C9 V6 k1 G( v: f
" C( D8 i1 m) t  t& O
   转录的时候，目的基因和EGFP会被转录在一条mRNA上。但是翻译的时候，会翻译成两条多肽链。目的基因的翻译是从mRNA的5`端开始，而EGFP的翻译是核糖体结合在IRES上开始的。
% }0 i+ s/ L; ^4 H: y9 {4 o- E1 h
9 }+ B( Y) ^, ?8 R8 F9 x   协同表达的优点：不影响目的蛋白的功能# S5 C/ H+ D. ~2 p6 |) |
                 缺点：EGFP不能反应目的蛋白在细胞内的定位7 u* I% l( T( s# I# P) x: o* M0 f4 O  K
                          EGFP和目的蛋白的表达不是1:1，所以EGFP会比融合表达的弱
! Q9 p# X. \) \! m; V  g  [+ }, o9 R! |
   融合表达 根据位置不同，分为N端融合 和 C端融合，但无论是那种目的基因和EGFP都会成为一个ORF。因此翻译后是一个融合蛋白。EGFP融合后会不会影响目的蛋白的生物学特性，要看目的蛋白本身。如果EGFP不影响目的蛋白的构象，那可能对目的蛋白的功能不会有太大的影响。如果你想知道你的目的蛋白有没有可能被影响，可以多看看文献。我发现高因子的文献里会N端和C端融合各做一个。
0 t; E/ G0 A/ L* D! D5 ^  }: y' z( D% W1 j! d% ?
     融合表达的优点： EGFP亮度比协同表达亮
; M. `+ h$ S: q$ N+ v: j                            能反映目的蛋白的细胞内定位7 Z* ~1 N7 ]+ F' n- Q- C7 z  O
& U  h  g. W- }; o
                   缺点： 可能会影响目的蛋白的功能

cc1986

回复 3# 绿雪
, `, U" `7 Z% \  y$ ?  |' j2 x; V1 ?; z: P6 Q

( L5 f7 R2 `% q& c6 |    请问 协同表达，和融合表达各有什么优缺点？ 目的基因和GFP的表达融合的话会不会影响目的蛋白的本来的生物学特性？如果不影响，可以理解融合表达要更好么？

cc1986

回复 2# 深海寂寞鱼 2 v$ `8 d( }4 n4 {, H& a% U9 \+ E
  j8 U9 G7 r% A' y) q2 {$ u+ P. G6 w$ g; ?
请问 协同表达，和融合表达各有什么优缺点？ 目的基因和GFP的表达融合的话会不会影响目的蛋白的本来的生物学特性？如果不影响，可以理解融合表达要更好么？

cc1986

回复 3# 绿雪
1 F( n1 [( U' l% Y2 Y" `: Z
5 z+ h( s5 u. v, S: k6 j非常感谢，现在基本明白了~~